摘要: 【目的】本研究旨在克隆并鉴定松墨天牛Monochamus alternatus内源漆酶基因MaLac1,分析其在松墨天牛不同发育阶段的表达水平,为进一步明确MaLac1功能提供依据。【方法】基于松墨天牛肠道转录组测序数据,通过RACE克隆松墨天牛MaLac1基因的全长cDNA序列,并对其进行生物信息学分析;将该基因与pET-32a载体链接构建表达载体pET-MaLac1,导入大肠杆菌Escherichia coli Rosetta (DE3)使其表达;使用qPCR检测MaLac1基因在松墨天牛不同发育阶段(低龄幼虫、老熟幼虫、蛹、雌成虫和雄成虫)肠道中的表达差异。【结果】克隆获得松墨天牛MaLac1的cDNA全长序列(GenBank登录号:KY073340)。MaLac1开放阅读框全长2 067 bp,编码一个含688个氨基酸的蛋白质,预测分子量为78.34 kD,等电点为5.30。SignalP 4.1 Server预测MaLac1在N端包含一个15个氨基酸的信号肽。序列比对分析表明,MaLac1具有典型的昆虫漆酶基因特征,与赤拟谷盗Tribolium castaneum漆酶基因的氨基酸序列一致性达93%。SDS-PAGE检测发现IPTG诱导表达了一条大约78 kD的特异蛋白条带,与推测大小一致。qPCR结果显示,MaLac1在不同发育阶段的松墨天牛肠道中均有表达,其中,在雌成虫肠道中表达量最高,在雄成虫肠道中的次之,在幼虫肠道中的最低。【结论】MaLac1在松墨天牛成虫中表达量显著高于其在幼虫中的,这一结果可能与幼虫和成虫的取食习性差异相关。MaLac1在松墨天牛体内的功能还有待进一步研究。

摘要: 【目的】本研究旨在建立携带与未携带松材线虫Bursaphelenchus xylophilus的松墨天牛Monochamus alternatus成虫各组织的转录组数据库,揭示松墨天牛对松材线虫响应的转录组整体表达特征。【方法】以携带和未携带松材线虫的松墨天牛成虫的表皮、气管和脂肪体为材料,采用Illumina HiSeq(TM) 2000测序平台开展转录组测序,利用Trinity软件对RNA-Seq数据进行从头组装,利用NCBI数据库进行基因注释。通过DEG-Seq分析携带和未携带松材线虫的松墨天牛成虫中的差异表达基因,对上调表达基因进行GO和KEGG代谢途径富集分析,并通过实时荧光定量PCR技术对部分差异表达的基因包括ENV, CDK1, HSP70-C, HSP70, HSP75, DUO, PABPN1和IGFP基因的表达水平进行验证。【结果】测序过滤后共获得55 059条单基因簇(unigene),平均长度为1 536 bp。将unigene与数据库中的序列进行BLASTX比对,成功注释24 354条unigenes,其中4 022条unigene在GO数据库中获得注释,6 098条unigene在KEGG数据库中获得注释。经过GO与KEGG富集分析显示,松墨天牛成虫携带松材线虫后,差异表达基因主要为与其气管中压力调节、组织与DNA修复、激素响应方面相关的基因。实时荧光定量PCR分析结果显示CDK1, HSP70, HSP75, DUO, PABPN1和IGFP基因的表达量在携带松材线虫的松墨天牛气管中相比未携带松材线虫的松墨天牛气管中的显著上调。【结论】本研究初步阐明松墨天牛携带松材线虫后转录组的整体表达模式,为进一步研究松墨天牛的基因功能及对松材线虫的胁迫响应过程奠定了基础。

摘要: 【目的】松墨天牛Monochamus alternatus是我国南方松林中的重要蛀干害虫,也是林业检疫性病害——松材线虫病的主要媒介昆虫,其分布范围较广,对温度的适应性强,本研究旨在初步探讨松墨天牛对温度胁迫适应性的分子机制。【方法】采用RT-PCR与RACE技术克隆松墨天牛小热激蛋白(small heat shock protein,sHSP)基因的全长cDNA,结合生物信息学方法分析小热激蛋白的结构特征;利用qPCR技术测定该基因在松墨天牛不同发育阶段、4龄幼虫不同组织及不同低温和高温胁迫下4龄幼虫中的表达谱,并用geNorm,NormFinder和BestKeeper软件对不同温度下内参基因稳定性进行评价。【结果】获得松墨天牛sHSP基因的cDNA全长序列,命名为MaltHSP21.20(GenBank登录号:MH091811),全长为871 bp,编码187个氨基酸,信号肽预测表明其N末端含有18个氨基酸的信号肽,成熟蛋白预测分子质量为21.20 kD,等电点为8.65。结构域预测符合小热激蛋白家族的特征,共含有10个β折叠片,在α结构域内含有7个β折叠片。进化树分析表明该蛋白氨基酸序列与光肩星天牛Anoplophora glabripennis的sHSP有较高的同源性。不同软件分析得到最稳定的内参基因存在差异,结合3种方法评价得出RPL10最为稳定。MaltHSP21.20在不同发育阶段的松墨天牛体内均有表达,滞育幼虫中表达量最高,卵期及蛹期表达量次之;在4龄幼虫不同组织中均有分布,脂肪体中表达量最高;4龄幼虫MaltHSP21.20对低温诱导无响应,其表达量在35℃时显著上调,45℃处理2和3 h最高,50℃时下降。【结论】RPL10是不同温度胁迫下较稳定的内参基因。相比其他热激蛋白基因,MaltHSP21.20对低温敏感性较低,推测其在幼虫滞育越冬及抵抗高温中发挥重要作用。

摘要: 【目的】探究被松墨天牛Monochamus alternatus携带的松材线虫Bursaphelenchus xylophilus对松墨天牛肠道和气管细菌的影响。【方法】野外采集携带松材线虫的松墨天牛成虫后，取出完整肠道和气管进行细菌总DNA抽提后进行16S rDNA基因测序并拼接，并利用生物信息学方法分析松墨天牛成虫肠道和气管细菌组成、结构、丰度和多样性。【结果】携带松材线虫的松墨天牛成虫肠道和气管细菌菌群共检测到15门26纲66目110科201属296种，可操作分类单元(operational taxonomic unit, OTU)数目为444。携带松材线虫的松墨天牛成虫比未携带松材线虫的松墨天牛成虫肠道优势细菌菌群变化不显著，均为变形菌门(Proteobacteria)肠杆菌目(Enterobacterales);携带松材线虫的松墨天牛成虫气管优势细菌菌群为变形菌门肠杆菌目，未携带松材线虫的松墨天牛成虫气管优势细菌菌群为厚壁菌门(Firmicutes)乳杆菌目(Lactobacillales)。携带松材线虫的松墨天牛成虫较未携带松材线虫的松墨天牛成虫气管细菌多样性和丰度升高，细菌群落结构显著不同；携带松材线虫的松墨天牛成虫肠道和气管中沙雷氏菌属Serratia和肠杆菌属Enterobacter富集。【结论】携带松材线虫后对松墨天牛成虫气管细菌菌群组成、结构、丰度和多样性都有显著影响，携带松材线虫的松墨天牛成虫气管中的沙雷氏菌属和肠杆菌属可能与松材线虫-松墨天牛复合体有紧密的联系。在携带松材线虫后，松墨天牛成虫气管中沙雷氏菌属增加，可能与松墨天牛气管免疫受抑制有关。本研究为解析松墨天牛肠道和气管细菌多样性提供了理论基础，为防控松材线虫提供了新的方向。

摘要: 【目的】明确松墨天牛Monochamus alternatus内生殖系统的结构及发育过程，为松墨天牛生殖机理研究及种群动态监测提供理论依据。【方法】选择不同日龄的松墨天牛雌雄成虫，采用组织解剖学方法结合光学显微镜对内生殖系统进行观察，明确其结构特征；通过发育级别划分，确定雌雄成虫内生殖系统的发育过程。【结果】松墨天牛雌成虫内生殖系统由1对卵巢、1对侧输卵管、中输卵管、交配囊、受精囊管、受精囊、受精囊腺、产卵器和生殖腔组成。根据雌成虫卵巢管和受精囊腺的形态和颜色将雌成虫性成熟发育过程划分为：乳白透明期(Ⅰ级)、卵黄沉积初期(Ⅱ级)、卵黄沉积盛期(Ⅲ级)和卵成熟待产期(Ⅳ级)。卵巢管在卵巢发育过程中不断增长，颜色由乳白透明转为黄色，受精囊腺的形态和颜色从扁平、半透明到饱满、黄色。雄成虫内生殖系统由1对精巢、2对附腺、1对输精管、1对贮精囊、1对射精管、环状器和阳茎组成。根据雄成虫精巢叶、贮精囊和附腺的形态和颜色将雄虫性成熟发育过程划分为：乳白透明期(Ⅰ级)、精子形成初期(Ⅱ级)、精子形成盛期(Ⅲ级)和成熟期(Ⅳ级)。精巢叶长径变化较小，精巢管、贮精囊和环状器颜色由乳白半透明到白色，附腺形态和颜色由细小半透明到膨大透明。松墨天牛雌、雄成虫的内生殖系统发育主要集中在ⅡⅢ级，就内生殖系统的发育进程而言，雄成虫发育速度更快，12日龄时内生殖系统已经发育成熟，而雌成虫在15日龄时内生殖系统发育成熟。【结论】明确了松墨天牛雌、雄成虫内生殖系统基本结构及其发育进程，不仅为进一步研究松墨天牛生殖机理提供了理论依据，还为生产实践中松墨天牛产卵高峰期的预测预报提供参考。