摘要: 【目的】Toll信号通路是昆虫天然免疫系统的重要组分,其中Toll受体在激活昆虫病原菌侵染免疫应答方面发挥了关键作用。本研究旨在探究斯氏按蚊Anopheles stephensi Toll受体基因在抵抗微生物侵染和维持肠道菌群稳态过程中的功能。【方法】根据冈比亚按蚊Anopheles gambiae Toll受体家族的蛋白氨基酸序列,通过序列同源比对鉴定斯氏按蚊中相应的Toll受体基因;运用荧光定量PCR检测Toll受体基因在未感染病原菌的斯氏按蚊脂肪体中的相对表达量,以及在真菌球孢白僵菌Beauveria bassiana和革兰氏阴性细菌胡萝卜软腐欧文氏菌Erwinia carotovora subsp.carotovora侵染斯氏按蚊过程中的表达变化;最后,在斯氏按蚊雌成蚊胸部显微注射AsToll1A和AsToll5A的双链RNA进行RNA干扰后,检测RNAi处理的斯氏按蚊受真菌侵染后的存活率、肠道细菌含量变化以及抗菌肽基因表达变化。【结果】在斯氏按蚊中共鉴定到8个Toll受体基因,即AsToll1A,AsToll5A,AsToll6,AsToll7,AsToll8,AsToll9,AsToll10和AsToll11。通过荧光定量PCR检测发现,未感染病原菌的斯氏按蚊雌成蚊脂肪体中AsToll5A表达量最高,AsToll1A表达量次之,其余Toll受体基因表达量极低。在球孢白僵菌和胡萝卜软腐欧文氏菌侵染过程中,与对照(注射PBS)比较,AsToll1A和AsToll5A在斯氏按蚊中的表达量显著升高,其余Toll受体基因表达变化不显著或降低。RNA干扰结果表明,AsToll1A或AsToll5A的表达受到抑制后,斯氏按蚊对球孢白僵菌的抵抗能力显著降低,肠道细菌总量与对照(dsGFP)比较显著增多。而且,抑制AsToll1A后抗菌肽基因DEF1和GAM1的表达受到显著抑制;抑制AsToll5A后仅有GAM1表达量下调。【结论】斯氏按蚊Toll受体在结构和功能上具有高度的保守性,其中AsToll1A和AsToll5A能响应病原真菌和革兰氏阴性细菌侵染并且影响肠道菌稳态。

摘要: 【目的】斯氏按蚊Anopheles stephensi是亚洲东南部城市人体疟疾的主要媒介,印度12%的疟疾病例由其引起。本实验研究了印度中部Madhya Pradesh地区东北部的疟疾强化控制(EMCP)区和非强化控制(非EMCP)区斯氏按蚊的基因流。在EMCP区,由于采用了各种疟疾防控措施因而疟疾病例首先降低,但是很快回升,说明总的疟疾风险维持稳定。【方法】应用7个微卫星位点,对印度中部Madhya Pradesh地区东北部的4个EMCP区和非EMCP区采集的斯氏按蚊进行基因分型,以分析各种群参数。【结果】发现各标记在所有种群中表现出高度的多态性。在两区间未发现很大的遗传多样性。观察到EMCP区的东部种群(FST=0.0485,RST=0.1112)比非EMCP区的北部种群(FST=0.020,RST=0.0145)具有较高的遗传分化,在EMCP区和非EMCP区之间观察到较高的基因流(12.90,6.16,5.06和2.38)。RST的灵敏度高于FST,说明分化可能是由于突变而非遗传漂变引起的。【结论】本研究表明,在EMCP区和非EMCP区内以及EMCP区和非EMCP区之间存在很高的基因流。基因流水平高以及抗虫性的发展似乎是EMCP区和非EMCP区疟疾病例发生增加的重要原因。

摘要: 了解敏感和抗性蚊虫的繁殖适合度对于规划和实施蚊虫防治计划具有重要意义。本研究分别将斯氏按蚊Anophelesstephensi幼虫用溴氰菊酯(AnDL)及溴氰菊酯和PBO混配制剂(1∶5)(AnDP),或斯氏按蚊成虫用溴氰菊酯(AnDA)进行选择后,在实验室内检测了起源于印度德里的斯氏按蚊亲本(AnS)和抗性品系(AnR)的繁殖适合度的变化,从繁殖力、生育力、卵孵化率和生殖营养周期的长度等方面评价了斯氏按蚊的繁殖适合度。结果表明:与AnS品系相比,AnR品系的生殖营养周期缩短了60%73%。与AnS品系相比,AnR品系的产卵量显著降低,降幅达14.5%37.9%,对溴氰菊酯抗性最强的AnDL40品系的产卵量降低得最多。这些结果说明溴氰菊酯抗性与繁殖劣势之间可能存在正相关。与亲本品系相比,AnDL40品系的卵孵化率降低了19.4%30.9%,进一步证实了这一相关性。在RDP品系中观察到繁殖适合度降低,表明溴氰菊酯增效剂的选择不仅在降低溴氰菊酯抗性水平而且在降低抗性个体频率上的效率。在对溴氰菊酯几乎不具有抗性的成虫品系的选择中繁殖适合度降低,暗示溴氰菊酯作为灭杀斯氏按蚊成虫剂的效果要好于作为杀幼虫剂的效果。这些结果提示,通过对斯氏按蚊实施不同抗性治理策略,种群中抗性基因型的繁殖适合度的降低可消除杂合子和抗性纯合子。

摘要: 天生免疫系统是昆虫抵御外界病原入侵的主要方式。目前研究发现,Imd信号通路与按蚊感染柏氏疟原虫Plasmodium berghei的强度密切相关,而PGRP-LC1是Imd信号通路最上游的受体之一。为了研究斯氏按蚊Anopheles stephensi肽聚糖识别蛋白PGRP-LC1,采用RT-PCR并结合RACE技术克隆斯氏按蚊PGRP-LC1基因,通过序列比较分析,得到两条cDNA序列,其开放阅读框分别为1365bp和1290bp,3′非编码区为320bp,5′非编码区为240bp。将两条cDNA分别命名为AsPGRP-LC1a(GenBank注册号GU214232)和AsPGRP-LC1b(GenBank注册号GU214233)。AsPGRP-LC1a编码454个氨基酸,分子量约为49.07kDa;AsPGRP-LC1b编码429个氨基酸,分子量约为46.3kDa。AsPGRP-LC1b比AsPGRP-LC1a少一个长度为75bp的外显子,该外显子在冈比亚按蚊Anopheles gambiae PGRP-LC1基因的某些可变剪切形式中也有发现。分别将两个斯氏按蚊PGRP-LC1基因在冈比亚按蚊细胞系L3-5和斯氏按蚊细胞系MSQ43中过量表达,通过双荧光素酶检测系统检测抗菌肽的表达情况,结果显示克隆得到的PGRP-LC1基因在两种细胞系中均能够启动Imd信号通路,为进一步研究斯氏按蚊的Imd信号通路提供了依据。

摘要: 本研究利用Tripure试剂盒 ,成功地提取了斯氏按蚊总RNA ,并对不同方法保存的标本所提RNA的质量进行了比较 ,结果显示新鲜标本所提RNA质量最高 ,将标本在Tripure提取液中匀浆后置于 4℃保存的方法 ,较其它两种方法保存效果更好 ,此方法保存的标本 5天内进行RNA提取 ,能够保证质量。