摘要: 铁硫亚基蛋白(rieske iron-sulfur protein,RISP)是线粒体复合物Ⅲ的关键蛋白亚基之一,在呼吸链电子传递过程中起到重要作用。本研究通过RT-PCR克隆得到斜纹夜蛾Spodoptera litura RISP基因SlitRISP的ORF,构建了pET32a-SlitRISP原核表达载体,SDS-PAGE和Western blot检测结果显示,SlitRISP原核表达蛋白以包涵体的形式存在于菌体沉淀中,且RISP抗体可成功用于该蛋白的免疫印迹检测。为了进一步鉴定SlitRISP在斜纹夜蛾离体细胞系SL-1中的功能,通过向细胞内转染siRNA,利用RNAi技术沉默SL-1中的SlitRISP。qRT-PCR结果表明,分别经50nmol/L和100nmol/L siRNA处理48h后,SL-1中SlitRISP的表达均几乎完全被抑制;Western blot结果显示,SL-1中SlitRISP含量显著低于CK。当SL-1SlitRISP被成功沉默后,通过检测SL-1线粒体膜电位、细胞ATP含量和细胞增殖抑制率鉴定RISP在线粒体电子传递过程中的重要作用。流式细胞仪测定结果表明,经50nmol/L和100nmol/LsiRNA处理24h后,SL-1线粒体膜电位相对于CK分别降低23.52%和11.32%,而处理48h后,SL-1线粒体膜电位则分别升高5.58%和27.66%;siRNA处理24h和48h后,SL-1ATP含量相对于CK分别降低82.71%和84.50%,最终导致SL-1细胞增殖抑制率分别为53.64%和67.94%。这些结果表明SlitRISP在SL-1中参与线粒体膜电位的形成和细胞ATP的合成。介于RISP在线粒体电子传递链中的重要作用,其可能成为新型杀虫作用靶标,这可为研制新型呼吸抑制剂提供参考。

摘要: 绿僵菌素A和B是生物活性分子,本研究用MTT法、相差显微观察、荧光倒置显微观察和流式细胞术比较了绿僵菌素A和B对斜纹夜蛾Spodoptera litura SL-1细胞的毒杀作用。结果表明:绿僵菌素A和B对SL-1细胞均具有明显的增殖抑制作用,且具有正比的时间-浓度-效应关系,绿僵菌素A和B处理细胞48h后的IC50值分别为7.80和20.73μg/mL。倒置相差显微观察发现,绿僵菌素A和B可以引起SL-1细胞变圆、胞膜收缩、有凋亡小颗粒形成。随着时间的延长,细胞悬浮致死并出现大量空泡和胞质外泄现象。但是在同样的处理浓度下,绿僵菌素A的作用较绿僵菌素B明显。用AO/EB染色后,荧光显微观察发现:绿僵菌素A诱导的细胞荧光强度高于绿僵菌素B。流式细胞仪检测结果表明:绿僵菌素A和B对SL-1细胞具有明显的致凋亡作用。10μg/mL绿僵菌素A和B作用细胞48h后,SL-1细胞的总凋亡率分别达78.88%±0.97%和72.23%±2.29%。本研究从细胞水平肯定了绿僵菌素具有良好的增殖抑制和致凋亡作用,并且为它在害虫防治中的潜在应用提供了一些理论支持。

摘要: 斜纹夜蛾核型多角体病毒(Spodoptera litura multinucleocapsid nucleopolyhdrovirus,SpltMNPV)X17株是采用活体克隆法自SpltMNPV日本小笠原株分离的病毒克隆。为了揭示X17病毒株基因型,根据已发表的SpltMNPVⅡ基因组全序列(GenBank登录号:NC_011616)设计引物,PCR扩增多角体蛋白基因(polh),并与SpltMNPV不同基因型及37种其他核型多角体病毒(NPV)作分子进化比较。系统发育树显示:SpltMNPV分为SpliNPV(A)型、SpltMNPV(B)型和SeMNPV(C)型3种基因型,此结果与前人利用基因组酶切图谱的研究结果一致。X17与SpltMNPV-1和SpltMNPVⅡ处于一个分支,属于SeMNPV(C)基因型,与A型和B型相距较远。此外,扩增了X17病毒基因38.7kD,Lef-1,Lef-9,fp,p10和p74,并与SpltMNPV,SpltMNPVⅡ,SeMNPV和SfNPV的同种基因进行同源性比较。结果表明,基于这6个ORF,X17与SpltMNPV同源性最低,其中Lef-9的氨基酸序列一致性最高,也仅为69%,38.7kD的氨基酸序列一致性只为26%。多数基因X17与SpltMNPVⅡ和SeMNPV的同源性较高,其中fp25K的氨基酸序列一致性最高,分别达95%和96%;但也有些基因同源性较低,如38.7kD的氨基酸序列一致性均为64%。因此,X17应是SpltMNPVC基因型的一种新毒株,命名为SpltMNPVⅡ-1。该研究为X17病毒株的进一步研究利用奠定基础。

摘要: 气味调控斜纹夜蛾Spodoptera litura的觅食、交配和产卵等行为,而嗅觉受体(olfactory receptor,OR)作为气味的直接受体,是嗅觉神经信号产生的起点,是嗅觉信息的编码及信号的传递通路的重要组成部分。本研究通过RT-PCR和Western blot技术,对斜纹夜蛾嗅觉受体基因Ⅱ(Spodoptera litura olfactory receptor geneⅡ,SlitOR2)(GenBank登录号:DQ845292)的组织特异性和不同发育阶段表达情况进行分析鉴定。半定量RT-PCR研究结果表明,SlitOR2主要在成虫期的触角中表达,其他部位和发育期未检测到表达。Western blot鉴定结果表明SlitOR2主要在成虫触角表达,与半定量RT-PCR结果基本一致。但在成虫足、头和中期蛹中也看到有微量蛋白表达。可能是与目的蛋白大小类似的其他非特异性蛋白条带,也可能是该蛋白在成虫足部、头部和中期蛹中有微量表达,因为足部的跗节和头部的口喙也分布有少量的嗅觉感器。目的条带单一清晰,表明制备的多肽抗体特异性较好,可以用于后续相关实验。

摘要: Fe-S蛋白(rieske iron-sulfur protein,RISP)是线粒体复合物Ⅲ的关键蛋白亚基之一,在呼吸链电子传递中起着重要作用。本文利用RT-PCR技术和RACE方法获得了斜纹夜蛾Spodoptera litura(Fab.)线粒体复合物ⅢRISP基因,该基因序列全长4413bp,含有3个内含子;开放阅读框长816bp,编码271个氨基酸。经氨基酸序列比对,与鳞翅目家蚕Bombyx mori和小菜蛾Plutella xylostella的Fe-S蛋白一致性较高,分别为83%和79%,与其他目昆虫的RISP一致性较低。qRT-PCR分析结果表明,SlitRISP基因在斜纹夜蛾不同发育阶段的表达水平存在显著差异,即幼虫期和成虫期的表达量显著高于卵期和蛹期,其中幼虫期又以第4和5龄幼虫表达水平显著高于初孵幼虫以及第1,2,3和6龄幼虫。斜纹夜蛾SlitRISP基因的克隆成功为今后对其功能研究以及作为靶标设计新型高效杀虫剂提供了基础。