摘要: 实验动物在生命科学领域起着重要的基础性支撑作用,其巨大贡献往往与以承受痛苦和死亡为代价。斑马鱼作为重要的模式生物,近年来成为应用最广泛的实验动物之一。如何在保护实验结果科学可靠的前提下保障斑马鱼福利,是本领域科研人员面对的重要问题。文章系统讨论了斑马鱼研究中实验动物福利的关键点,涵盖痛苦感知、水环境、饲育、实验操作、运输及安乐死等方面,为提升实验室斑马鱼生存质量,推动实验鱼标准化进程提供理论支撑与实践参考。

摘要: 通过稀有鮈鲫(Gobiocypris rarus)卵膜蛋白质组测序鉴定黏性卵膜中富集的透明带蛋白(Zona pellucida glycoproteins, Zps),建立可用于卵型研究的稀有鮈鲫zp基因突变体和转基因斑马鱼(Danio rerio)。实验收集稀有鮈鲫胚胎(1hour post fertilization, hpf),分离收集足量卵膜,提取卵膜中的蛋白质进行测序分析。将测序数据进行拼接并与鲤科鱼类蛋白质进行比对,选取匹配度和丰度最高的基因zp2l2和zp4l进行实验。分别在zp2l2和zp4l的第一个外显子、第六个外显子设计CRISPR/Cas9敲除靶点,构建zp基因突变体。扩增斑马鱼zp3.2基因上游启动子序列(2874 base pairs, bps)和zp2l2、zp4l编码序列(1137、3009 bp),通过无缝克隆(Infusion cloning)将zp3.2启动子连接进入具有Tol2转座元件的质粒中,构得质粒pT2AL-zp3.2-eGPF;再将zp2l2、zp4l编码序列克隆到pT2AL-zp3.2-eGPF质粒中,得到可用于胚胎注射的转基因质粒pT2AL-zp3.2-zp2l2-eGPF和pT2AL-zp3.2-zp4l-eGPF。体外转录合成转座酶mRNA与构建的转基因质粒混合进行斑马鱼胚胎显微注射。通过稀有鮈鲫胚胎显微注射及三代鉴定,成功在稀有鮈鲫中敲除zp2l2和zp4l获得稳定遗传的纯合突变体;稀有鮈鲫zp转基因斑马鱼经传代鉴定,筛选得到了可稳定遗传的转基因品系Tg(zp3.2:zp2l2-eGPF)和Tg(zp3.2:zp4l-eGPF),这2个转基因品系的绿色荧光蛋白在斑马鱼胚胎发育的15d(days post fertilization, dpf)开始在卵巢和肝脏中表达。实验构建zp2l2和zp4l稀有鮈鲫突变体和转基因斑马鱼的方法,为鲤科鱼类卵型形成机制的研究提供了可行的实验思路和技术路线。