摘要: 以某动物园中经临床观察、病理学检查、血液细胞和血液生化分析方面诊断为缺硒的4只斑马为研究对象,3只健康斑马作为对照,分析缺硒斑马血液细胞和血液生化检测值的变化,探讨斑马缺硒病的诊断方法。结果表明:缺硒病斑马的红细胞数量和血红蛋白量下降,中性粒细胞百分比上升而淋巴细胞百分比下降,血液生化指标分析显示乳酸脱氢酶、丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶和肌酸激酶活性升高,尿酸含量和谷胱甘肽过氧化物酶活力显著下降。这一结果在斑马缺硒病的诊断中具有重要意义。

摘要: CRISPR/Cas9系统介导的定点突变已经在多种模式生物中实现,其中提高sgRNA的编辑效率是关键性因素。通过分析斑马鱼Danio rerio sgRNA序列特征,优化现有sgRNA设计原则,提高了CRISPR/Cas9系统在斑马鱼中的切割效率。根据现有的sgRNA设计原则,利用软件CHOPCHOP和Benchling对斑马鱼内35个基因设计157个sgRNAs并分析其序列特征对基因突变效率的影响。结果表明,CRISPR/Cas9系统对斑马鱼产生高效靶向突变的sgRNA序列具有明显的碱基偏好性。当靶点序列和靶点种子序列的GC含量为50%～60%、紧邻靶点3’端的前间区序列邻近基序可变碱基为C、Cas9蛋白复合体的切割位点碱基对为AC时,靶点序列具有较高的切割效率。同时,对6个已发表数据集的959个sgRNAs的序列特征进行重新分析,得到了类似的结果。优化的sgRNA设计原则,能显著提高靶基因的突变效率。

摘要: 为了提高CRISPR/Cas9基因编辑系统的基因编辑效率,研究设计优化了Cas9蛋白,并通过大肠杆菌密码子优化、原核表达、固定化金属亲和层析、分子筛层析及超滤离心浓缩获得了具有较高纯度和活性的HeiCas9蛋白。将HeiCas9蛋白、Cas9蛋白(T品牌)、zcas9 mRNA分别以不同的浓度梯度,配合斑马鱼黑色素合成关键基因tyr的gRNA,在斑马鱼胚胎中进行了tyr基因敲除,比较了不同组别的tyr基因编辑效率。在400 ng/μL的工作浓度(为获取最佳基因编辑效果而建议的剂量)下, HeiCas9蛋白比T品牌的Cas9蛋白发挥出更高的基因编辑效率,并保持了较低的胚胎毒性。进一步将HeiCas9蛋白用于稀有鮈鲫dnd和金鱼prkdc的基因敲除,取得了良好的效果。综上,研究成功制备出了高活性的HeiCas9蛋白,并在3种实验室小型鱼类胚胎的基因编辑中取得了良好的应用效果。

摘要: 为了探究斑马鱼中肝糖代谢是否存在两性异形,研究通过对野生型斑马鱼进行肝脏形态学观察（透射电子显微镜）、组织学分析、肝糖原含量测定,发现雄性个体的肝糖原含量显著高于雌性（P<0.01）。在stat5b突变体(stat5b^–/–)中进行组织学分析、肝糖原（Liver Glycogen,LG）测定,结果显示,stat5b^–/–雄性个体的肝糖原含量明显低于对照组（P<0.05）,而雌性中无显著差异（P>0.05）。基于此,stat5b基因功能的缺失削弱了肝糖原含量的两性异形。通过转录组分析筛选出差异表达基因并进行KEGG通路富集分析,发现这些差异表达基因显著富集在糖代谢相关的通路中,并从中筛选出可能与Stat5b具有互作关系的候选基因糖原合成酶2 （Glycogen Synthase 2,gys2）。转录因子结合位点（Transcription Factor Binding Site,TFBS）预测和双荧光素酶报告基因实验的结果显示,TFBS的预测区域具有转录活性,Stat5b正调控gys2。在stat5b过表达转基因（stat5b-TG）斑马鱼中发现,雄性个体的肝糖原含量明显高于对照组（P<0.05）,而雌性中并无显著差异（P>0.05）。所以,过表达stat5b增大了肝糖原含量的两性异形,这与stat5b突变体的趋势相反。转录因子Stat5b可能通过转录调控gys2来调节肝糖原合成的两性异形,从而维持鱼类的肝糖原代谢稳态。

摘要: 为探究全氟辛烷磺酸(Perfluorooctane sulfonate, PFOS)对鱼类的肠道毒性,将雌雄斑马鱼分别暴露于0、1和10 mg/L的PFOS中21d,通过存活率、肠道组织切片、16S rRNA高通量测序、实时荧光定量PCR等技术检测斑马鱼肠道形态结构及微生物菌群的变化。结果表明:暴露于10 mg/L PFOS的斑马鱼死亡率明显高于1 mg/L,且对雄鱼的影响大于雌鱼。1 mg/L浓度组雌雄鱼的存活率分别为93.3%和83.3%,而10 mg/L为33.3%和13.3%。1 mg/L PFOS暴露使斑马鱼的肠壁厚度轻微变薄、肠绒毛有破损的现象。10 mg/L浓度组肠壁厚度明显变薄,肠绒毛高度降低、肠黏膜上皮细胞肿胀并伴随严重的溶解现象。PFOS暴露21d后,肠道组织的炎症相关基因肿瘤坏死因子α (TNF-α)、白介素1β (IL-1β)和白介素10 (IL-10),以及细胞凋亡相关基因胱天蛋白酶3 (Caspase 3)、p53、B淋巴细胞瘤-2 (Bcl2)的表达量均显著高于对照组,且Caspase3和p53基因在雄鱼的肠道的表达量显著高于雌鱼(P<0.05)。PFOS暴露显著增加了肠道菌群的多样性,改变了肠道菌群结构。厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteriota)和拟杆菌门(Bacteroidota)的相对丰度均显著增加,而梭杆菌门(Fusobacteria)显著下降。在属水平, PFOS处理增加了罗尔斯通菌属(Ralstonia)和假单胞菌属(Pseudomonas)相对丰度,而降低鲸杆菌属(Cetobacterium)和气单胞菌属(Aeromonas)。两个处理组肠道菌中厚壁菌门/拟杆菌门(F/B)的比值高于对照组。PFOS处理增强了肠道菌群的氨基酸及脂代谢功能,但削弱了聚糖的合成与代谢能力。综上所述, PFOS长期暴露会引起水生动物的肠道结构损伤及微生物菌群失调,进而影响动物的健康。