摘要: 研究利用CRISPR/Cas9技术构建了斑马鱼elovl8a~(-/-)、elovl8b~(-/-)和DKO(elovl8a和elovl8b)敲除模型,通过组织学观察、实时荧光定量PCR和脂肪酸组成分析等实验方法,探究了脂肪酸延长酶8(elovl8)缺失对斑马鱼抗冷胁迫能力的影响。结果表明elovl8缺失导致斑马鱼在低温环境下的存活率显著降低,肝脏伴有明显的脂质沉积和脂肪病变。实时荧光定量PCR结果显示elovl8a和elovl8b缺失造成脂质代谢相关基因的显著变化:elovl8a~(-/-)肝脏中硬质酰-辅酶A脱氢酶(scd)和乙酰辅酶A羧化酶a(acaca)转录水平显著升高,脂肪分解基因包括脂肪甘油三酯脂肪酶(pnpla2)、激素敏感性脂解酶a(lipea)和脂蛋白脂解酶(lpl)表达量显著下降。elovl8b~(-/-)肝脏中脂肪合成酶(fasn)、scd、acaca及pnpla2、lipea和lpl表达水平都显著升高,而DKO肝脏中脂质代谢基因表达都显著下降。脂肪酸分析显示,在低温胁迫下elovl8的缺失造成肝脏C20:0脂肪酸的显著累积,表明elovl8可能对C20:0的延长有作用。研究证明了elovl8在斑马鱼抗冷胁迫过程中起到重要作用,为后续鱼类抵抗低温机制的研究提供新的思路。

摘要: 为鉴定鱼类肌肉组织特异性顺式调控元件,通过分析斑马鱼多个组织的转录组数据,筛选出肌肉高表达基因及低表达基因。通过MEME对肌肉高表达基因和低表达基因非编码区序列特征进行分析,在5个肌肉高表达基因的转录起始位点上游发现了序列保守的DNA区域,包含6个排列顺序一致的DNA基序。将其中一段目标片段插入具有Tol2转座子元件的基础启动子驱动的eGFP编码基因的上游,构建表达载体。注射载体至斑马鱼受精卵获得转基因胚胎,分析胚胎中eGFP荧光的表达模式,发现该DNA片段具有增强基因在肌肉特异性表达的功能。Tomtom预测该DNA区域可能作为Myod等多个转录因子的结合位点。研究结果有助于理解鱼类肌肉基因表达的遗传基础,并为利用生物信息学方法预测组织特异性转录调控元件提供新思路。

摘要: 为了研究豆粕替代鱼粉对鱼类肠黏膜免疫的影响和建立缓解肠炎药物的筛选及功能性饲料添加剂的平台,研究采用固有免疫或适应性免疫细胞荧光标记的斑马鱼品系,通过50%的豆粕添加量替代鱼粉作为蛋白源,共设计了两组饲料,分别在幼鱼固有免疫或适应性免疫的发育阶段中饲喂荧光标记的斑马鱼,构建了斑马鱼豆粕诱导的肠炎模型,对构建的食源性肠炎模型进行了病理、免疫细胞及分子水平的探索。结果表明,在固有免疫方面,斑马鱼通过增加中后肠的中性粒细胞和巨噬细胞的招募、诱导巨噬细胞形态发生抗炎/促炎状态的转换(如形成免疫突触、抗炎/促炎细胞因子等),来应对食源性急性肠炎;在适应性免疫阶段,豆粕饲料促进斑马鱼中后肠淋巴细胞的聚集,包括未成熟的淋巴细胞以及成熟的T淋巴细胞,并且也可发生抗炎/促炎状态转换。从肠道组织病理来说,豆粕替代鱼粉蛋白源会造成肠黏膜损伤,结合切片HE染色显示的肠道物理屏障受到破坏的病理,目前qPCR结果可推测肠道细胞凋亡增加,肠上皮层紧密连接变弱并出现代偿性的细胞增生,同时促炎因子表达增加,免疫细胞聚集肠道,暗示免疫屏障也受损。值得一提的是,斑马鱼幼鱼的适应性免疫发育阶段,即可发生类似成鱼的肠黏膜免疫调控来应对食源性肠炎,例如通过提高调节性免疫细胞转录因子(foxp3)及效应因子(il-10、tgf-beta)来提高肠黏膜的免疫耐受。因此,研究从模式生物的角度,提供了一种快速、可视化的水产动物的食源性肠炎模型及相关功能饲料添加剂的在体研发平台。

摘要: 用CRISPR/Cas9技术敲除斑马鱼(Danio Rerio)的trim47,收集TRIM47~(-/-)(trim47基因敲除)和WT(野生型)斑马鱼的大脑和脾脏进行RNA-seq分析,以鉴定差异表达基因(DEGs)。总共确定了271个DEGs,经过简要分析,将这些DEGs注释为KEGG途径和GO富集分析,与WT组相比, TRIM47~(-/-)组的脑中DEGs集中在细胞黏附和谷氨酸能突触信号传导途径中。在脾脏中,与野生型组相比, TRIM47~(-/-)组的DEGs在补体和凝血级联信号通路中发生了变化。使用qRT-PCR验证了脑和脾中与补体途径相关的基因,与转录组数据一致。这些结果表明, Trim47在脾脏和大脑中起着重要的生物学作用,尤其是通过补体途径参与先天免疫功能。体内感染实验表明, trim47基因敲除可提高斑马鱼中鲤春病毒血症病毒(SVCV)的感染率。总之,这些发现为TRIM成员在先天免疫中的功能提供了新线索。

摘要: 分别以斑马鱼(Danio rerio)和鲤(Cyprinus carpio L.)为研究材料,通过克隆斑马鱼和鲤miR-1-2和133a-1的基因间增强子序列,利用活体和离体实验探讨其是否具有肌肉特异性;并通过荧光素酶报告系统等研究转录因子MyoD是否调控该序列。研究结果显示:在活体实验中,无论斑马鱼还是鲤, miR-1-2/133a-1基因间序列均有肌肉特异性,且保留有保守区域(cr,含有E-box)的序列,注射72h后GFP表达量明显高于其他突变体。体外细胞实验也显示,转染含有cr序列的实验组,分化后的荧光素酶活性明显高于分化前。进一步探讨MyoD对miR-1-2/133a-1基因间序列的调控作用结果显示:无论是斑马鱼还是鲤, miR-1-2/133a-1基因间序列活性均受MyoD调控。结果为完善鱼类肌肉发育机理,及未来的鱼类分子育种奠定基础。