摘要: 通过稀有鮈鲫(Gobiocypris rarus)卵膜蛋白质组测序鉴定黏性卵膜中富集的透明带蛋白(Zona pellucida glycoproteins, Zps),建立可用于卵型研究的稀有鮈鲫zp基因突变体和转基因斑马鱼(Danio rerio)。实验收集稀有鮈鲫胚胎(1hour post fertilization, hpf),分离收集足量卵膜,提取卵膜中的蛋白质进行测序分析。将测序数据进行拼接并与鲤科鱼类蛋白质进行比对,选取匹配度和丰度最高的基因zp2l2和zp4l进行实验。分别在zp2l2和zp4l的第一个外显子、第六个外显子设计CRISPR/Cas9敲除靶点,构建zp基因突变体。扩增斑马鱼zp3.2基因上游启动子序列(2874 base pairs, bps)和zp2l2、zp4l编码序列(1137、3009 bp),通过无缝克隆(Infusion cloning)将zp3.2启动子连接进入具有Tol2转座元件的质粒中,构得质粒pT2AL-zp3.2-eGPF;再将zp2l2、zp4l编码序列克隆到pT2AL-zp3.2-eGPF质粒中,得到可用于胚胎注射的转基因质粒pT2AL-zp3.2-zp2l2-eGPF和pT2AL-zp3.2-zp4l-eGPF。体外转录合成转座酶mRNA与构建的转基因质粒混合进行斑马鱼胚胎显微注射。通过稀有鮈鲫胚胎显微注射及三代鉴定,成功在稀有鮈鲫中敲除zp2l2和zp4l获得稳定遗传的纯合突变体;稀有鮈鲫zp转基因斑马鱼经传代鉴定,筛选得到了可稳定遗传的转基因品系Tg(zp3.2:zp2l2-eGPF)和Tg(zp3.2:zp4l-eGPF),这2个转基因品系的绿色荧光蛋白在斑马鱼胚胎发育的15d(days post fertilization, dpf)开始在卵巢和肝脏中表达。实验构建zp2l2和zp4l稀有鮈鲫突变体和转基因斑马鱼的方法,为鲤科鱼类卵型形成机制的研究提供了可行的实验思路和技术路线。

摘要: 为验证一种高度特异性的新型CBE在鱼类中的应用效果,研究以调控鱼类肌间刺形成的关键基因runx2b为目的基因,在斑马鱼上探讨其对构建的单碱基突变品系的编辑效率、表型和相关基因表达等方面的影响。结果表明F₀代的编辑效率达60%,突变体的肌间刺数量减少约55%,且其自交繁殖产生的F₁代仅有杂合子和纯合子的存在,纯合比例达70%以上,纯合子的肌间刺全部缺失且可稳定遗传。Western Blot蛋白表达结果显示Runx2b蛋白在突变体内不表达, RT-qPCR定量结果也显示成骨分化和矿化相关基因（entpd5a、sp7和alpl）表达在突变体中显著降低。研究表明CBE在鱼类上具有较高的编辑效率,可有效编辑斑马鱼runx2b基因,获得无肌间刺表型,缩短获得纯合突变品系的世代时间,为鱼类高效精准的基因编辑育种提供了新的途径。