摘要: 目的探讨斑马鱼尿酸氧化酶基因的克隆与原核表达的方法,研究重组斑马鱼尿酸氧化酶(ZUO)的理化性质与生物学功能。方法用PCR的方法克隆斑马鱼尿酸氧化酶基因,用pET28a质粒进行原核表达。结果成功克隆了斑马鱼尿酸氧化酶基因并完成了测序鉴定,该基因在大肠杆菌表达系统中得到有效表达且具有体外氧化尿酸的生物学功能。目的蛋白为胞内可溶性蛋白,占可溶蛋白总量的50%左右。最佳诱导条件为27℃16 h,粗酶最佳溶解pH为9.16,在此缓冲液溶解条件下,粗酶比活性为1.94 U/mg。获得的重组ZUO产量达64.8 U/g湿菌,高于直接从动物肝脏组织萃取的尿酸氧化酶。结论斑马鱼尿酸酶基因能在大肠杆菌表达系统中表达,其溶解pH比基因工程表达的重组猪尿酸氧化酶略低,对后续开发痛风治疗新药有利。

摘要: 目的研究异甘草素对斑马鱼Danio rerio var.胚胎发育、血管生成以及心脏的影响。方法异甘草素处理受精后10 h、24 h的正常斑马鱼胚胎,显微镜下观察并记录药物作用12 h、24 h、36 h、48 h后斑马鱼胚胎发育、血管生成、心率以及心脏形态。结果异甘草素浓度为4μg·mL^-1时可轻度抑制斑马鱼胚胎尾部发育,浓度为12μg·mL^-1及以上时会严重抑制胚胎发育。异甘草素具有抑制斑马鱼胚胎血管生成作用,浓度为2μg·mL^-1时即可抑制血管的生成,8μg·mL^-1时甚至完全抑制尾部静脉血管的生成。异甘草素可显著降低斑马鱼胚胎心率,中低剂量下,心率随着作用时间增加呈先降后升的趋势,对心脏形态无影响;高剂量下,心率随作用时间增加而降低,异甘草素致斑马鱼胚胎心包与卵黄囊肿大。结论中低剂量异甘草素具有良好的抗血管生成和减慢心率的作用,高剂量时随着作用时间延长具有一定的抑制发育作用。

摘要: CRISPR/Cas9系统介导的定点突变已经在多种模式生物中实现,其中提高sgRNA的编辑效率是关键性因素。通过分析斑马鱼Danio rerio sgRNA序列特征,优化现有sgRNA设计原则,提高了CRISPR/Cas9系统在斑马鱼中的切割效率。根据现有的sgRNA设计原则,利用软件CHOPCHOP和Benchling对斑马鱼内35个基因设计157个sgRNAs并分析其序列特征对基因突变效率的影响。结果表明,CRISPR/Cas9系统对斑马鱼产生高效靶向突变的sgRNA序列具有明显的碱基偏好性。当靶点序列和靶点种子序列的GC含量为50%～60%、紧邻靶点3’端的前间区序列邻近基序可变碱基为C、Cas9蛋白复合体的切割位点碱基对为AC时,靶点序列具有较高的切割效率。同时,对6个已发表数据集的959个sgRNAs的序列特征进行重新分析,得到了类似的结果。优化的sgRNA设计原则,能显著提高靶基因的突变效率。

摘要: 为了提高CRISPR/Cas9基因编辑系统的基因编辑效率,研究设计优化了Cas9蛋白,并通过大肠杆菌密码子优化、原核表达、固定化金属亲和层析、分子筛层析及超滤离心浓缩获得了具有较高纯度和活性的HeiCas9蛋白。将HeiCas9蛋白、Cas9蛋白(T品牌)、zcas9 mRNA分别以不同的浓度梯度,配合斑马鱼黑色素合成关键基因tyr的gRNA,在斑马鱼胚胎中进行了tyr基因敲除,比较了不同组别的tyr基因编辑效率。在400 ng/μL的工作浓度(为获取最佳基因编辑效果而建议的剂量)下, HeiCas9蛋白比T品牌的Cas9蛋白发挥出更高的基因编辑效率,并保持了较低的胚胎毒性。进一步将HeiCas9蛋白用于稀有鮈鲫dnd和金鱼prkdc的基因敲除,取得了良好的效果。综上,研究成功制备出了高活性的HeiCas9蛋白,并在3种实验室小型鱼类胚胎的基因编辑中取得了良好的应用效果。

摘要: 为了探究斑马鱼中肝糖代谢是否存在两性异形,研究通过对野生型斑马鱼进行肝脏形态学观察（透射电子显微镜）、组织学分析、肝糖原含量测定,发现雄性个体的肝糖原含量显著高于雌性（P<0.01）。在stat5b突变体(stat5b^–/–)中进行组织学分析、肝糖原（Liver Glycogen,LG）测定,结果显示,stat5b^–/–雄性个体的肝糖原含量明显低于对照组（P<0.05）,而雌性中无显著差异（P>0.05）。基于此,stat5b基因功能的缺失削弱了肝糖原含量的两性异形。通过转录组分析筛选出差异表达基因并进行KEGG通路富集分析,发现这些差异表达基因显著富集在糖代谢相关的通路中,并从中筛选出可能与Stat5b具有互作关系的候选基因糖原合成酶2 （Glycogen Synthase 2,gys2）。转录因子结合位点（Transcription Factor Binding Site,TFBS）预测和双荧光素酶报告基因实验的结果显示,TFBS的预测区域具有转录活性,Stat5b正调控gys2。在stat5b过表达转基因（stat5b-TG）斑马鱼中发现,雄性个体的肝糖原含量明显高于对照组（P<0.05）,而雌性中并无显著差异（P>0.05）。所以,过表达stat5b增大了肝糖原含量的两性异形,这与stat5b突变体的趋势相反。转录因子Stat5b可能通过转录调控gys2来调节肝糖原合成的两性异形,从而维持鱼类的肝糖原代谢稳态。