摘要: 目的建立利用斑马鱼胚胎快速鉴定真核质粒中目的基因表达的实验体系。方法选20枚斑马鱼受精卵,在显微镜下每隔1h记录胚胎的发育情况。另选250枚单细胞期斑马鱼胚胎,平均分成5组,一组胚胎作为对照,剩余4组分别向胚胎的单细胞内注射pEGFP-N1(真核表达质粒)、pCMV-DsRed-Express2(真核表达质粒)、pET28-GFP(原核表达质粒)、pET28-RFP(原核表达质粒)质粒,在不同时间点连续观察绿色荧光及红色荧光的表达情况。另选600枚单细胞期斑马鱼胚胎,平均分成3组,一组胚胎作为对照,一组向胚胎单细胞内注射pEGFP-N1质粒,另外一组向胚胎单细胞内注射pEGFP-N1-MUC1外源基因融合重组质粒,注射4h后在荧光显微镜下观察绿色荧光的表达情况,并用RT-PCR的方法检测目的基因MUC1mRNA的转录情况。结果注射pEGFP-N1、pCMV-DsRed-Express2真核表达质粒的胚胎,注射4h后分别观察到很强的绿色荧光及红色荧光;注射pET28-GFP、pET28-RFP原核表达质粒的胚胎,10h内都未观察到绿色荧光及红色荧光;注射pEGFP-N1-MUC1外源基因融合质粒,注射4h后同样观察到很强的绿色荧光,且用RT-PCR方法检测到目的基因MUC1很强的表达。结论利用斑马鱼胚胎鉴定真核重组质粒中目的基因的表达情况是一种快速、有效的实验体系。

摘要: 通过RT-PCR法由斑马鱼脾脏克隆B细胞刺激因子baff基因,构建过表达斑马鱼baff且携带有绿色荧光标记蛋白的重组质粒pIRES2-GFP-baff;胚胎显微注射获得转基因斑马鱼胚胎;通过GFP荧光标记跟踪并筛选转基因阳性鱼;Western blot法鉴定Baff-GFP融合蛋白表达情况;qPCR检测baff,GFP及baff下游相关基因bcl-2,il-4mR-NA表达情况。结果表明细胞、胚胎及幼鱼baff和GFP均高表达,baff下游基因bcl-2激活和il-4基因抑制表达。通过胚胎显微注射法可成功获得过表达baff的转基因斑马鱼,此研究为建立红斑狼疮转基因斑马鱼模型及高通量筛选Baff拮抗剂奠定了基础。

摘要: 斑马鱼作为一种新的理想模式动物,已在发育生物学、环境毒理学和人类疾病及相关基因功能等研究中得到广泛应用。本文就建立斑马鱼胚胎的显微注射基因分析平台进行了探究,并通过piwil2基因的抑制和过表达实验验证了平台的可操作性,也对建立平台中所要注意的问题进行了讨论。

摘要: 目的以Tol2为骨架载体,以绿色荧光蛋白(GFP)、Cherry为报告基因,探讨采用2A肽双基因载体构建策略构建单启动子双基因共表达质粒的方法;将B细胞刺激因子(BAFF)分别置于2A序列前后位置,分析位置效应对跨膜融合蛋白的表达与剪切的影响,探讨多基因共表达转基因斑马鱼构建技术。方法以In Fusion法将GFP-2A-Cherry序列构建到Tol2质粒上,所得p Tol-GFP-2A-Cherry质粒转染He La细胞、显微注射1-细胞期斑马鱼受精卵;倒置荧光显微镜观察He La细胞、斑马鱼幼鱼体内GFP与Cherry蛋白的表达,Western blot法验证GFP和Cherry蛋白的表达量与剪切情况;分别构建p Tol2-GFP-2A-BAFF与p Tol2-BAFF-2A-Cherry质粒,Western blot法检查BAFF的表达与剪切情况。结果 p Tol2-GFP-2A-Cherry质粒转染的He La细胞,GFP与Cherry均可单独表达且表达呈现时空一致性;GFP-2A-Cherry融合蛋白可被剪切为GFP与Cherry,且成等比例表达趋势。p Tol2-GFP-2A-Cherry质粒显微注射1-细胞期斑马鱼受精卵可获得可单独表达GFP与Cherry蛋白的转基因斑马鱼;p Tol2-GFP-2A-BAFF与p Tol2-BAFF-2A-Cherry于斑马鱼体内均有融合蛋白的表达,且BAFF序列位于2A序列后更易于融合蛋白的剪切。结论通过2A肽策略构建可实现在斑马鱼体内单一载体、单一启动子调控双基因表达目的。发现编码跨膜分泌蛋白的功能基因位于2A序列的不同位置会直接影响蛋白的剪切,功能基因位于2A序列后易于跨膜蛋白的剪切。

摘要: 目的探讨温度对斑马鱼胚胎发育速度及器官分化的影响。方法将带绿色荧光的转基因斑马鱼胚胎分配至3个培养皿中,各放160个胚胎,分别放置于28.5℃(标准发育温度)、31℃(高温)和25℃(低温)3个不同温度中进行孵育,孵育至3 h、6 h、10 h、24 h和48 h时进行观察拍照,并在36 h、48 h和72 h时用荧光显微镜观察胚胎的心脏和血管,比较不同温度对胚胎发育进程及各器官发育的影响。结果 3种温度下,胚胎存活率分别为92.5%、89.4%和91.25%,没有显著性差异。相同发育时间内,与标准温度中发育的胚胎相比,31℃中的胚胎发育较快,而25℃的胚胎发育所处的时期较早。发育到相同分期,31℃所需时间比标准温度短,而25℃所需时间长。3个不同温度下,胚胎心脏和血管的发育均不受影响。结论高温促进胚胎发育,低温延迟发育,但高温或低温均不影响胚胎器官正常发育。结合实际科研需要,可通过调控温度来调节斑马鱼胚胎的发育进程。