摘要: 为了研究鱼类的甲基转移酶set9 [SET domain containing (lysine methyltransferase) 9,也称作set7/setd7]在低氧耐受中的功能,以斑马鱼(Danio rerio)作为模式生物,利用CRISPR/Cas9 (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 9)基因编辑技术,在斑马鱼set9基因的第一个外显子上设计了Cas9的靶位点,对其进行基因敲除,获得了缺失8个碱基的set9基因敲除的斑马鱼品系。对受精后3d的斑马鱼幼鱼和3月龄的斑马鱼成鱼进行低氧胁迫处理,比较了野生型及set9基因敲除的斑马鱼的低氧耐受能力;并对低氧胁迫处理后的3月龄的野生型及set9基因敲除的斑马鱼成鱼的脑组织取材、固定并进行TUNEL染色。结果显示:set9基因敲除的斑马鱼与野生型相比,其低氧耐受能力显著增强,脑组织中的细胞凋亡水平显著减少。研究为进一步揭示鱼类甲基转移酶set9在低氧耐受中的功能和分子机制提供了线索,并为培育耐低氧鱼类新品种提供了候选靶标。

摘要: 为探讨环境浓度多西环素长期暴露对斑马鱼焦虑行为、学习记忆、认知灵活性及肠道菌群的影响,采用不同环境浓度多西环素(0、0.01、0.1和1μg/L)对斑马鱼成鱼进行水体暴露染毒21d后,采用新缸实验、Y迷宫、明暗实验和斑马鱼行为学高通量监测系统方法检测环境浓度多西环素对斑马鱼行为学和肠道菌群的影响。结果表明:在新缸实验中,与对照组相比, 0.01、0.1和1μg/L浓度组斑马鱼平均游泳速度显著降低;随着多西环素浓度升高,斑马鱼最大游泳速度和总游动距离与对照组相比呈现下降趋势,其中1μg/L浓度组同对照组相比差异显著;在底部区域停留时间上,与对照组相比, 0.01、0.1和1μg/L组均有升高, 0.01μg/L差异显著。在Y迷宫实验中, 0.01μg/L浓度组斑马鱼在探索臂停留时间与对照组相比显著增加, 0.1和1μg/L浓度组显著降低; 0.01μg/L浓度组斑马鱼在探索臂的转弯角度与对照组相比增加,而0.1和1μg/L浓度组显著降低。在明暗实验中,斑马鱼在光区停留时间随着多西环素浓度增加具有上升的趋势。在斑马鱼行为学高通量监测系统实验中,斑马鱼总游动距离随着多西环素浓度的增加呈现下降趋势,其中1μg/L浓度组同对照组相比差异显著。基于16S rRNA测序技术对肠道菌群进行分析, 12份肠道样本共获得1454814条原始有效序列,筛选后获得1314404条优质序列供后续分析。同时利用DADA2方法降噪,以100%相似度聚类,发现多西环素各浓度组减少了斑马鱼肠道菌群的丰度,博斯氏菌属、副球菌属、不动杆菌等菌属丰度降低,棒状杆菌属和漫游球菌等菌属丰度升高。香农指数、辛普森指数和chao1指数染毒组同对照组相比显著降低,此外,主坐标分析中多西环素组和对照组之间的群落不同。综上,环境浓度多西环素长时间暴露能够引起斑马鱼行为改变,产生焦虑样行为, 0.01μg/L浓度组能够提高斑马鱼短期学习记忆能力和认知灵活性;多西环素长期暴露引起斑马鱼肠道菌群丰度和多样性改变。

摘要: 研究旨在通过双荧光素酶报告基因实验探究斑马鱼notch1a和notch1b基因对hsp70的调控作用。通过NCBI数据库检索获取了斑马鱼notch1a和notch1b基因的CDS序列,对其胞内段(Notch1a/Notch1b intracellular domain, N1aICD/N1bICD)进行克隆并构建pCMV-N1aICD和pCMV-N1bICD真核表达载体,在人胚肾细胞(HEK293T)中用Western Blot和亚细胞定位检测N1aICD和N1bICD的表达。通过生信分析并克隆斑马鱼hsp70启动子序列,构建pGL3-hsp70-pro报告基因,并在HEK293T中检测该报告基因的双荧光素酶活性。之后在HEK293T细胞中过表达notch1a和notch1b基因,通过双荧光素酶报告基因实验检测pGL3-hsp70-pro的活性变化,以此探究notch1a和notch1b对hsp70基因的调控作用。实验结果显示真核表达载体pCMV-N1aICD和pCMV-N1bICD构建成功, Western Blot显示pCMV-N1aICD和pCMV-N1bICD可正常表达,亚细胞定位显示N1aICD和N1bICD蛋白表达在HEK293T的细胞核中;双荧光素酶实验显示pGL3-hsp70-pro报告基因在HEK293T细胞中具有活性,是阴性对照质粒的3.7倍;在HEK293T细胞中pCMV-N1aICD和pCMV-N1bICD真核表达载体能够显著增强pGL3-hsp70-pro的活性,分别为对照组的4.9倍和5.1倍。实验结果表明斑马鱼notch1a和notch1b基因可显著增强hsp70基因的表达,为进一步研究Notch分子通过Hsp70进行抗感染免疫的分子机制提供了实验材料并奠定了理论基础。

摘要: 三唑磷作为一种广泛使用的有机磷杀虫剂,该药物在自然水体中的残留可对非靶标生物产生潜在威胁,文章旨在探究三唑磷对斑马鱼的毒性效应。研究将3月龄雌性斑马鱼(Danio rerio)持续暴露于环境相关浓度的三唑磷(10μg/L) 21d,然后与健康雄鱼自然受精产卵;通过测定雌鱼生殖力、亲代与子代的氧化应激及子代胚胎发育相关指标,评估三唑磷对亲代雌鱼及其子代的毒性效应。主要研究结果:亲代雌鱼经10μg/L三唑磷暴露后,产卵量显著提高(P<0.05),肝脏内乙酰胆碱酯酶(AChE)活性显著降低(P<0.05),丙二醛(MDA)含量显著增加(P<0.05),超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)和羧酸酯酶(CarE)活性均显著增强(P<0.05);所产子代胚胎受精率、受精卵直径、胚胎心率和初孵仔鱼体长均显著降低(P<0.05),仔鱼畸形率显著增加(P<0.05),孵化率无显著性差异;仔鱼AChE与SOD活性呈下降趋势但差异不显著, MDA含量显著增加(P<0.05), GPx与GST活性显著降低(P<0.05), CarE活性显著提高(P<0.05)。以上研究结果表明环境浓度三唑磷21d暴露可提高雌性斑马鱼的生殖力,诱导亲代及子代氧化应激反应,并对子代胚胎发育过程产生不良影响。

摘要: Rspo1 (R-spondin 1)是分泌型Rspos (R-spondins)蛋白家族的成员,在雌性发育、血管生成和癌症等多个方面具有调控作用。为了研究Rspo1在早期胚胎发育中的功能,以斑马鱼(Danio rerio)作为模式生物,利用反转录PCR及原位杂交技术检测rspo1基因的时空表达模式;通过显微注射rspo1 mRNA或rspo1反义寡核苷酸(Morpholino, MO)对rspo1进行过表达或敲降;通过形态观察及原位杂交技术检测胚胎汇聚延伸(Convergence and extension, CE)运动是否正常;利用荧光素酶活性检测实验测定Wnt/PCP信号通路活性水平;通过蛋白印迹法检测表征Wnt/PCP信号通路活性的磷酸化JNK (Jun N-terminal kinase)蛋白的水平。结果显示:rspo1为母源基因,在12hpf前胚胎中呈全身性表达, rspo1的过表达或敲降均影响胚胎的CE运动;过表达rspo1降低Wnt/PCP信号通路报告质粒的活性,而敲降rspo1则增加其活性,与之相一致, rspo1敲降的胚胎中磷酸化JNK的水平显著升高;此外, rspo1 mRNA与dnJNK (Dominant negative JNK) mRNA的共同注射,以及rspo1MOs与wnt11或wnt5b mRNA的共同注射均能协同诱导CE运动缺陷。综上,在斑马鱼胚胎中, Rspo1通过负调控Wnt/PCP信号通路来调控胚胎的汇聚延伸运动。