摘要: 【目的】以中华按蚊Anopheles sinensis蛹后期至成虫期的体壁中高表达的表皮蛋白基因AsCPR75的启动子序列为调控元件，创制可在蛹-成虫期体壁中转录Cas9的中华按蚊转基因遗传改造品系。【方法】基于中华按蚊组织（中肠、马氏管、卵巢、脂肪体、触角、唾液腺、精巢和体壁）转录组数据集系统筛选其体壁中高量表达的表皮蛋白基因，利用qPCR验证候选基因在不同发育阶段（卵、1-4龄幼虫、蛹和成虫）及成虫头胸和腹中的表达量；选取目标基因翻译起始位点上游4 000 bp的序列作为候选启动子区，构建可驱动Cas9条件性转录的转基因质粒，并通过胚胎显微注射中华按蚊雌成蚊，对子代个体进行荧光筛选，利用反向PCR检测阳性个体中转基因表达盒的插入位点，利用qPCR检测转基因品系在不同发育阶段（蛹和成虫）及羽化0 h成虫体壁中Cas9的转录表达量。【结果】筛选到在中华按蚊蛹后期至成虫期体壁中高表达的表皮蛋白基因AsCPR75。qPCR分析证实AsCPR75自蛹期24 h上调表达，至成虫期0 h具有最高的表达量。AsCPR75在成虫头胸和腹中高表达，且腹部体壁中的表达量明显高于腹部其他部位的；构建了pBac-[3XP3-EGFP-SV40-AsCPR75-promoter-Cas9-SV40]转基因质粒；在G₁代中筛选到幼虫单眼和成虫复眼呈现绿色荧光的转基因个体。反向PCR分析确认了两个转基因品系中外源表达盒分别插入到scaffold25的第487 522位和scaffold14的第29 949 095位碱基处。进一步检测显示，转基因阳性个体中可检测到Cas9的转录表达，且其时期表达趋势与内源AsCPR75基本一致。【结论】本研究成功构建了可介导Cas9在中华按蚊体壁中稳定表达的转基因品系。这可为后续着眼于中华按蚊体壁的条件性基因组编辑，以及将体壁作为靶标组织的蚊虫遗传控制策略的建立提供有价值的工具素材。

摘要: 【目的】本研究旨在克隆中华按蚊Anopheles sinensis法尼酸甲基转移酶(famesoic acid O-methyltransferase, FAMeT)基因AsFAMeT,分析其分子特性并探究其在发育不同阶段及成蚊不同组织中的表达模式，为阐明FAMeT的生物学功能及保幼激素合成通路作用提供理论依据。【方法】基于中华按蚊基因组数据克隆中华按蚊AsFAMeT的cDNA全长序列，对其编码蛋白质进行生物信息学分析。构建pCold-TF-AsFAMeT重组质粒，转化至大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)感受态细胞，经IPTG诱导表达重组蛋白；镍柱纯化AsFAMeT重组蛋白并制备多克隆抗体，通过Western blotting检测抗体的特异性。利用RT-qPCR检测AsFAMeT在中华按蚊不同发育阶段(卵、1-4龄幼虫、雌雄蛹和雌雄成蚊)以及3日龄雌雄成蚊不同组织(头、胸、腹、马氏管、脂肪体、中肠、卵巢、精巢和体壁)中的表达量。【结果】克隆获得中华按蚊AsFAMeT cDNA全长序列(GenBank登录号：PV368360),开放阅读框长1 050 bp,编码349个氨基酸残基，预测AsFAMeT分子量为37.02 kD,等电点为4.64,无信号肽序列和跨膜结构域；中华按蚊AsFAMeT与冈比亚按蚊An.gambiae和达林按蚊An.darlingi FAMeTs高度同源，氨基酸序列一致性分别为77.71%和69.43%;制备的多克隆抗体能够特异识别AsFAMeT蛋白。AsFAMeT在中华按蚊发育不同阶段以及3日龄雌雄成蚊的各组织中均有表达，在4龄幼虫和雌雄蛹中均表达量较高。AsFAMeT在3日龄成蚊体壁、卵巢和精巢中的表达量显著高于在其他组织中，在马氏管和中肠中的表达量低。Western blotting蛋白定量结果与RT-qPCR结果基本一致。【结论】本研究成功克隆并原核表达中华按蚊AsFAMeT,制备的特异性多克隆抗体能够特异识别中华按蚊的天然AsFAMeT蛋白，探究了中华按蚊不同发育阶段和雌雄成蚊不同组织中AsFAMeT的表达谱，为深入了解AsFAMeT在中华按蚊生长发育和生殖调控中的分子机制提供了重要依据。

摘要: 【目的】保幼激素环氧水解酶(juvenile hormone epoxide hydrolase, JHEH)作为保幼激素代谢通路的关键酶，在昆虫生长发育和生殖调控中起着重要的作用。中华按蚊Anopheles sinensis是疟疾等重要疾病的主要传播媒介，目前对于其JHEH基因在中华按蚊中的作用尚不清楚。本研究旨在解析中华按蚊JHEH的分子特性和基因表达模式，探究JHEH在中华按蚊生殖中的作用。【方法】基于中华按蚊转录组和基因组数据，利用PCR技术扩增中华按蚊AsJHEH的cDNA序列；通过生物信息学工具解析预测AsJHEH的理化特性和结构特征，使用MAGE11.0构建系统进化树；利用RT-qPCR检测AsJHEH在中华按蚊不同发育阶段(卵、1-4龄幼虫、雌蛹、雄蛹和雌雄成虫；化蛹后0, 10, 20和30 h,末期雌蛹以及羽化后0, 6, 12, 24, 36, 48, 60和72 h的雌成虫)、雌雄成虫不同组织(头、胸和腹)、雌成虫不同组织(中肠、马氏管、脂肪体、卵巢和体壁)中的表达量；构建pET32a-AsJHEH原核表达载体，诱导蛋白表达并纯化重组蛋白，制备AsJHEH多克隆抗体；向中华按蚊末期雌蛹注射dsAsJHEH进行RNAi后通过RT-qPCR和Western blotting检测基因沉默效率，并观测中华按蚊成虫羽化率、卵巢发育和单雌产卵量以及羽化后吸血24和48 h成虫中AsVg的表达量。【结果】成功克隆获得中华按蚊AsJHEH cDNA序列(GenBank登录号：PV466834),长为1 389 bp,编码462个氨基酸，编码蛋白质的预测分子质量为53.02 kD,等电点(isoelectric point, pI)为6.20。AsJHEH含有保守的结构基序，包括催化三联体(Asp234-Glu411-His438)、氧离子孔(Tyr306和Tyr81)以及XWG和HGXP基序。AsJHEH与其他蚊科昆虫JHEH的亲缘关系最近。时空表达模式发现，AsJHEH在中华按蚊各个发育阶段和成虫组织中均有表达，在2龄幼虫中表达量最高，是雌成虫中表达量的888.98倍；在雄成虫头部中高表达，表达量为雌成虫卵巢中表达量的1 198.54倍。通过原核表达系统成功制备了AsJHEH重组蛋白，并获得多克隆抗体效价为1∶128 000。与注射dsEGFP的对照组比较，AsJHEH RNAi后，AsJHEH在中华按蚊mRNA水平和蛋白水平的表达量均显著下降，中华按蚊羽化率下降了26.67%,同时卵巢发育异常，羽化后吸血48 h成虫中AsVg的表达量上调了1.8倍，单雌产卵量降低了52.23%,且所产的卵长度增加了0.2倍并丧失了孵化能力。【结论】本研究首次揭示了AsJHEH在中华按蚊生长发育和生殖调控中具有关键作用，不仅为基于保幼激素降解通路的中华按蚊防治奠定了理论基础，更为研发基于JH代谢的蚊虫生物防治策略提供了潜在分子靶点，具有重要的理论意义与实践价值。

摘要: 【目的】热激蛋白（heat shock protein, Hsp）是生物体遭受不利环境胁迫时迅速产生的一类抗逆蛋白，可帮助生物机体度过不利环境。本研究旨在探究Hsp90AB在中华按蚊Anopheles sinensis生长发育、杀虫剂胁迫和溴氰菊酯抗性中的作用机制，为深入研究该基因的作用机制及中华按蚊的防控提供理论依据。【方法】基于中华按蚊转录组和基因组数据，采用RT-PCR克隆AsHsp90AB的全长cDNA序列，并利用生物信息学对该基因序列进行分析；利用RT-qPCR检测AsHsp90AB在中华按蚊溴氰菊酯敏感品系（WX-LS）和抗性品系（WX-LR）不同发育阶段（卵、 1-4龄幼虫、雌蛹、雄蛹、雌成蚊和雄成蚊）和雌成蚊不同组织（唾液腺、中肠、马氏管、脂肪体、体壁和卵巢）中的表达模式；利用幼虫浸渍（敏感基线法）半致死中浓度(median lethal concentration, LC₅₀)（0.0016 mg/L）溴氰菊酯和WHO接触桶法（0.05%溴氰菊酯药膜）分别胁迫WX-LS的4龄幼虫和3日龄雌成蚊，利用RT-qPCR检测AsHsp90AB的表达达量；通过显微注射法利用RNAi技术沉默中华按蚊WX-LR雌蛹中AsHsp90AB,利用RT-qPCR检测AsHsp90AB的表达量，观察统计RNAi后48 h时WHO接触桶法0.05%溴氰菊酯药膜处理后雌成蚊的半数击倒时间(median knockdown time, KT₅₀)、击倒率和存活率。【结果】克隆出中华按蚊AsHsp90AB（GenBank登录号：PP405608） 2 678 bp的全长cDNA序列，开放阅读框长2 154 bp,编码718个氨基酸，预测蛋白质理论分子量和等电点分别为81.65 kD和4.94,具有典型的Hsp90家族基因的特征基序，含有MEEVD基序，为细胞质型。系统进化分析上显示，中华按蚊AsHsp90AB与按蚊属Anopheles的Hsp90s聚为一支，再与库蚊属Culex的Hsp90s聚在一起，说明它们之间的亲缘关系较近。AsHsp90AB在WX-LS和WX-LR整个发育阶段持续表达，在WX-LS中雄成蚊和雌成蚊卵巢中表达量最高；在WX-LR 4龄幼虫中高表达和雌成蚊触角中表达量最高。溴氰菊酯胁迫后中华按蚊WX-LS 4龄幼虫和3日龄雌成蚊中AsHsp90AB表达量分别上调了1.37～2.61倍和1.91～2.58倍，而被击倒的雌成蚊AsHsp90AB表达量下调了72.51%。RNAi抑制了中华按蚊WX-LR雌蛹中AsHsp90AB的表达，RNAi后24, 48和72 h时AsHsp90AB的表达量比对照组dsEGFP显著降低，分别下调44.00%, 61.09%和55.95%。注射dsAsHsp90AB的中华按蚊WX-LR雌成蚊在0.05%溴氰菊酯药膜处理后10 min时开始被击倒，dsEGFP对照组雌成蚊是30 min时开始才被击倒，在0.05%溴氰菊酯药膜处理1 h期间的击倒率逐渐升高，两组的击倒率差异显著。dsEGFP对照组雌成蚊的KT₅₀为（50.000±1.667） min, dsAsHsp90AB处理组雌成蚊的KT₅₀值为（30.000±0.600） min。在0.05%溴氰菊酯药膜处理后转移至恢复桶恢复24 h时沉默AsHsp90AB的WX-LR雌成蚊的存活率比dsEGFP对照组的显著升高了24.5%。【结论】AsHsp90AB在WX-LR中高表达，沉默该基因后中华按蚊在溴氰菊酯胁迫下死亡率提高。本研究为AsHsp90AB在中华按蚊生长发育和溴氰菊酯抗性中的潜在功能提供有价值的参考。

摘要: 【目的】本研究旨在探究第2代拟除虫菊酯类杀虫剂高效氯氟氰菊酯对中华按蚊Anopheles sinensis的亚致死效应。【方法】采用WHO推荐使用的幼虫浸渍法，测定高效氯氟氰菊酯对中华按蚊4龄幼虫的毒力；使用LC₁₀和LC₃₀亚致死浓度高效氯氟氰菊酯处理中华按蚊4龄幼虫，记录其F₁代各发育阶段历期和日单雌产卵量，并构建年龄-龄期两性生命表，利用TIMING-MSChart预测未来60 d种群动态变化。【结果】高效氯氟氰菊酯对中华按蚊4龄幼虫24 h的LC₁₀和LC₃₀值分别为0.95×10^-3和2.17×10^-3 mg/L。与对照（去氯自来水）相比，LC₁₀浓度高效氯氟氰菊酯显著缩短了中华按蚊F₁代雌虫卵历期和2龄幼虫历期，但显著延长了F₁代雌虫1和3龄幼虫历期及蛹历期进而导致总发育历期延长；F₁代雄虫则表现为显著延长的1和2龄幼虫历期及蛹历期，显著缩短的3龄幼虫历期及成虫寿命。与对照相比，LC₃₀浓度高效氯氟氰菊酯显著延长了中华按蚊F₁代雌虫3龄幼虫和蛹历期及总发育历期，显著缩短了1和4龄幼虫历期；并且显著延长雄虫1龄幼虫历期，显著缩短了2和3龄幼虫历期和成虫前期。此外，与对照相比，LC₁₀浓度高效氯氟氰菊酯显著缩短中华按蚊成虫产卵前期（adult pre-viposition period, APOP）和平均世代周期（mean generation time,T）,而LC₃₀浓度高效氯氟氰菊酯则显著延长T。与对照相比，两个浓度高效氯氟氰菊酯均抑制中华按蚊F₁代雌成虫产卵量，且LC₃₀浓度高效氯氟氰菊酯的抑制效应更为显著。【结论】亚致死浓度高效氯氟氰菊酯显著影响中华按蚊的生长发育和繁殖力。LC₁₀浓度高效氯氟氰菊酯通过缩短中华按蚊发育历期和增加世代数，轻微促进了种群增长；而LC₃₀浓度高效氯氟氰菊酯显著抑制了雌虫繁殖力，并抑制了种群增长。本研究结果可为合理使用高效氯氰菊酯防治中华按蚊提供参考。