摘要: 【目的】本研究旨在通过饲喂法对意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica工蜂幼虫肠道中ame-miR-bantam进行过表达与敲减，明确ame-miR-bantam对靶基因USP和P300表达的调控作用。【方法】通过饲喂ame-miR-bantam模拟物(mimic-ame-miR-bantam)和抑制物(inhibitor-ame-miR-bantam)及相应的阴性对照mimic-NC-ame-miR-bantam和inhibitor-NC-ame-miR-bantam,对意大利蜜蜂工蜂4-6日龄幼虫肠道组织中的ame-miR-bantam分别进行过表达和敲减。利用生物信息学软件进行ame-miR-bantam的靶向预测及分析。通过RT-qPCR检测4-6日龄意大利蜜蜂工蜂幼虫肠道中ame-miR-bantam的过表达和敲减效果及靶基因USP和P300的相对表达量。【结果】相较于饲喂mimic-NC-ame-miR-bantam,饲喂mimic-ame-miR-bantam后，ame-miR-bantam在意大利蜜蜂4-6日龄工蜂幼虫肠道中均显著上调；相较于饲喂inhibitor-NC-ame-miR-bantam,饲喂inhibitor-ame-miR-bantam后，ame-miR-bantam在4日龄工蜂幼虫肠道中显著下调，在5日龄和6日龄工蜂幼虫肠道中下调表达。ame-miR-bantam共靶向222个基因，可注释到细胞进程等35个GO条目和Wnt信号通路等160条KEGG通路。相比于饲喂mimic-NC-ame-miR-bantam的阴性对照组，过表达ame-miR-bantam后，4日龄工蜂幼虫肠道中USP和P300的表达量均为上调；5日龄工蜂幼虫肠道中USP的表达量下调，P300显著下调表达；6日龄工蜂幼虫肠道中USP和P300均显著下调表达。相比于饲喂inhibitor-NC-ame-miR-bantam的阴性对照组，敲减ame-miR-bantam后，4和5日龄工蜂幼虫肠道中USP和P300的表达量均为上调；6日龄工蜂幼虫肠道中USP显著上调表达，P300的表达量上调。【结论】通过饲喂模拟物和抑制物能够分别实现意大利蜜蜂工蜂幼虫肠道中ame-miR-bantam的有效过表达和敲减；幼虫肠道中ame-miR-bantam可负调控USP和P300的表达。

摘要: 【目的】本研究旨在通过饲喂ame-miR-79的模拟物(mimic)和抑制物(inhibitor)对意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica工蜂幼虫肠道内的ame-miR-79分别进行过表达和敲减，探究ame-miR-79对幼虫肠道内靶基因表达的调控作用。【方法】通过分子克隆与Sanger测序验证意大利蜜蜂工蜂幼虫肠道内ame-miR-79的序列真实性。通过饲喂mimic-miR-79和inhibitor-miR-79对意大利蜜蜂工蜂4-6日龄幼虫肠道内的ame-miR-79分别进行过表达和敲减。采用相关生物信息学软件进行ame-miR-79的靶基因预测与分析。通过RT-qPCR检测ame-miR-79的过表达和敲减效果及过表达和敲减ame-miR-79后靶基因的相对表达量。【结果】ame-miR-79在意大利蜜蜂工蜂幼虫肠道内真实存在。与无义模拟物(nonsense mimic, mimic-NC)组相比，mimic-miR-79组的4-6日龄幼虫肠道内ame-miR-79的表达量皆极显著上调；与无义抑制物(nonsense inhibitor, inhibitor-NC)组相比，inhibitor-miR-79组的4和5日龄幼虫肠道内ame-miR-79的表达量显著下调，6日龄幼虫肠道内ame-miR-79的表达量极显著下调。ame-miR-79共靶向303个基因，涉及27个GO条目和179条KEGG通路。相较于mimic-NC组，靶基因细胞色素P450基因CYP450在mimic-miR-79组的4和5日龄幼虫肠道内均极显著下调表达，而在6日龄幼虫肠道内上调表达；靶基因fringe糖基化转移酶(fringe glycosyltransferase, FG)基因在4日龄幼虫肠道内下调表达，在5日龄幼虫肠道内显著下调表达，而在6日龄幼虫肠道内上调表达。相较于inhibitor-NC组，CYP450在inhibitor-miR-79组的4日龄幼虫肠道内极显著上调表达，在6日龄幼虫肠道内上调表达，而在5日龄幼虫肠道内下调表达；FG的表达水平在4日龄幼虫肠道内显著上调，在5和6日龄幼虫肠道内极显著上调。【结论】ame-miR-79在意大利蜜蜂工蜂幼虫肠道内真实存在；通过饲喂模拟物和抑制物能分别实现意大利蜜蜂工蜂幼虫肠道内ame-miR-79的有效过表达和敲减；ame-miR-79负调控意大利蜜蜂工蜂幼虫肠道内CYP450和FG的表达。

摘要: 【目的】Piwi蛋白互作RNA(PIWI-interacting RNA, piRNA)在昆虫的发育和免疫等重要生物学过程发挥重要的调控作用。本研究旨在丰富西方蜜蜂Apis mellifera的piRNA信息，并为进一步探究差异表达piRNA(differentially expressed piRNA, DEpiRNA)调控意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica工蜂中肠发育的分子机理提供基础。【方法】基于已获得的意大利蜜蜂7日龄(Am7)和10日龄(Am10)工蜂中肠的small RNA(sRNA)组学数据，对piRNA进行预测和分析。将质控后的sRNA数据比对西方蜜蜂参考基因组，再将比对上的序列标签(tags)进一步比对数据库以滤除rRNA和tRNA等小非编码RNA(non-coding RNA, ncRNA),进而根据piRNA的长度特征鉴定piRNA。采用TPM(tags per million)算法对piRNA表达量进行计算和归一化处理。根据|log_2 fold change|≥1且P≤0.05的标准筛选Am7 vs Am10比较组的DEpiRNA。通过相关软件预测DEpiRNA的靶mRNA并进行GO和KEGG数据库注释。利用Cytoscape软件对DEpiRNA-mRNA调控网络进行可视化。通过Stem-loop RT-PCR对随机选取的Am7与Am10两组共有的6个piRNA的表达进行验证。利用RT-qPCR对随机挑选的6个DEpiRNA的表达趋势进行验证。【结果】从意大利蜜蜂工蜂中肠中共鉴定到596个piRNA,长度介于2433 nt,且Am7和Am10组中不同长度分布范围的piRNA的首位碱基偏向性具有明显差异。在Am7 vs Am10比较组共筛选出41个DEpiRNA,其中piR-ame-11093, piR-ame-1111451, piR-ame-190949和piR-ame-932156可分别靶向1 195, 1 018, 4 040和1 063条mRNA。上述靶mRNA可分别注释到45个功能条目和45条通路。Stem-loop RT-PCR验证结果显示6个piRNA (piR-ame-1084826, piR-ame-11093, piR-ame-14476, piR-ame-24995, piR-ame-39500和piR-ame-774987)均真实表达。RT-qPCR结果显示共有6个DEpiRNA (piR-ame-1084826, piR-ame-11093, piR-ame-14476, piR-ame-24995, piR-ame-39500和piR-ame-774987)的表达趋势与测序数据中的表达趋势一致，证实了本研究中sRNA-seq数据的可靠性和piRNA差异表达趋势的真实性。【结论】本研究从意大利蜜蜂工蜂中肠中鉴定到596个piRNA,长度介于2433 nt。不同长度分布范围的piRNA的首位碱基偏向性具有明显差异；piR-ame-11093, piR-ame-1111451, piR-ame-190949和piR-ame-932156具有靶向调控基因表达参与工蜂中肠发育过程的潜力。

摘要: 【目的】微小RNA(microRNAs, miRNAs)在昆虫的繁殖、发育和免疫等重要生命活动的调控过程中扮演关键角色。本研究旨在探究在意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica幼虫个体水平过表达与敲减ame-miR-13b对其靶基因表达的影响，为深入探究ame-miR-13b调控意大利蜜蜂幼虫肠道发育的分子机理提供理论和实验依据。【方法】根据ame-miR-13b的核苷酸序列设计合成相应的模拟物mimic-ame-miR-13b和抑制物inhibitor-ame-miR-13b及其对照mimic-NC和inhibitor-NC,混入饲料后饲喂意大利蜜蜂3日龄幼虫，每12 h更换一次饲料，连续饲喂6次，以分别过表达和敲减ame-miR-13b;通过RT-qPCR检测过表达和敲减ame-miR-13b后意大利蜜蜂幼虫肠道中ame-miR-13b及其靶基因Ecr,Egfr和P450 18a1的表达量。【结果】与mimic-NC饲喂组相比，mimic-ame-miR-13b饲喂组中ame-miR-13b在意大利蜜蜂4和6日龄幼虫肠道中均显著上调表达；与饲喂inhibitor-NC组相比，inhibitor-ame-miR-13b饲喂组中ame-miR-13b在4日龄幼虫肠道中下调表达，在5和6日龄幼虫肠道中显著下调表达。与mimic-NC饲喂组相比，过表达ame-miR-13b组中意大利蜜蜂6日龄幼虫肠道中Egfr的表达量显著降低，而Ecr和P450 18a1的表达量均显著升高。与inhibitor-NC饲喂组相比，敲减ame-miR-13b组中意大利蜜蜂6日龄幼虫肠道中Egfr上调表达但不显著，Ecr显著上调表达，而P450 18a1显著下调表达。【结论】通过饲喂法在意大利蜜蜂幼虫个体中成功实现了miRNA的过表达和敲减；ame-miR-13b与Egfr之间存在潜在的负调控关系。

摘要: 【目的】意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica是生产性能优良的西方蜜蜂Apis mellifera亚种。本研究旨在利用分子生物学手段揭示3种微小RNA(microRNA, miRNA) ame-miR-13b, ame-miR-100和ame-miR-bantam调控蛹期变态发育的分子机理。【方法】通过stem-loop RT-PCR验证ame-miR-13b, ame-miR-100和ame-miR-bantam在意大利蜜蜂工蜂蛹期的真实表达。通过RT-qPCR检测ame-miR-13b, ame-miR-100, ame-miR-bantam和靶mRNA在意大利蜜蜂工蜂蛹期发育过程的表达谱。利用相关生物信息学软件预测在意大利蜜蜂工蜂蛹期ame-miR-13b, ame-miR-100和ame-miR-bantam的靶mRNA,构建和分析miRNA-mRNA调控网络以及对靶mRNA进行数据库注释。【结果】ame-miR-13b, ame-miR-100和ame-miR-bantam在意大利蜜蜂工蜂蛹期发育过程真实表达且表达量总体均呈动态上升趋势;可分别靶向850, 136和506条mRNA,并与其靶mRNA之间形成较复杂的调控网络;这些靶mRNA可分别被注释到32, 24和33个GO条目,以及204, 114和171条KEGG通路。【结论】ame-miR-13b, ame-miR-100和ame-miR-bantam潜在通过调控蜕皮激素基因、yellow基因以及Hippo, FoxO, Wnt, Jak-STAT和Notch信号通路相关基因的表达共同影响意大利蜜蜂工蜂蛹期的变态发育过程。