摘要: 本文旨在探讨恶性疟原虫野生株体外培养的驯化方法。在中缅边境流行区采集12株野生型恶性疟原虫样本,采用添加ALBUMAX II、次黄嘌呤的改进配方,通过逐渐脱离灭活去纤维蛋白原人血浆的培养方式进行人工驯化临床恶性疟原虫株。分别对灭活去纤维蛋白原人血浆对野生型虫株驯化过程及驯化后生长的影响做统计学分析。结果表明灭活去纤维蛋白原人血浆对野生株体外驯化过程生长的影响具有统计学意义,对人工驯化后生长影响不具有统计学意义。最终N13-1231和F08B38两虫株经驯化后可脱离灭活去纤维蛋白原人血浆连续培养。本文成功对中缅边境流行区恶性疟原虫野生株N13-1231和F0838进行驯化,可脱离灭活去纤维蛋白原人血浆连续培养,具有科学研究价值。

摘要: 恶性疟原虫PfMAg-1蛋白为裂殖子表面相关蛋白,为了探究PfMAg-1的功能,本研究采用规律成簇间隔短回文重复及相关失活蛋白（Clustered regulatory interspaced short palindromic repeats/dead CRISPRassociated protein 9,CRISPR/d Cas9）技术,构建恶性疟原虫PfMAg-1低表达质粒,电穿孔方法转染后通过抗稻瘟菌素（Blasticidin S Deaminase,BSD）筛选出恶性疟原虫MAg1^KD（Knock Down,KD）虫株。通过聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction,PCR）、实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitative Real Time Polymerase Chain Reaction,q RT-PCR）检测PfMAg-1表达水平。在体外培养条件下观察MAg1^KD虫株生长趋势及裂殖子入侵效率来评价PfMAg-1的表达对恶性疟原虫红内期增殖的影响。结果表明,恶性疟原虫MAg1^KD虫株较对照虫株的体外生长率显著降低,进一步实验提示影响疟原虫增殖速度的原因是MAg1^KD虫株裂殖子入侵效率下降。本研究证实PfMAg-1在恶性疟原虫裂殖子入侵红细胞时发挥重要作用,为进一步评价PfMAg-1蛋白作为疟疾疫苗候选抗原的前景提供了实验依据。

摘要: 为了评价纳米乳作为佐剂对恶性疟疾人工重组蛋白疫苗M.RCAg-1免疫原性的影响,将纳米乳佐剂与M.RCAg-1相配伍,于第0、14、28 d肌肉注射免疫小鼠,抗原量为20μg/只。第3次免疫后10 d,眼球取血并取脾细胞。采用ELISA法检测小鼠血清特异性Ig G抗体水平、抗体亚类及其对抗原单表位的识别,用间接免疫荧光反应(IFA)检测抗体对恶性疟原虫天然蛋白的识别,用ELISPOT法检测小鼠脾淋巴细胞免疫应答水平。结果显示疫苗佐剂组小鼠血清中抗M.RCAg-1的抗体水平可达1∶108;疫苗佐剂组产生的特异性Ig G抗体以Ig G1为主;疫苗佐剂组抗体对抗原单表位和天然虫体的识别效果显著。各表位和蛋白诱发免疫小鼠分泌IFN-γ的特异性淋巴细胞克隆数高于分泌IL-4的特异性淋巴细胞克隆数。结果提示纳米乳作为恶性疟疾疫苗M.RCAg-1的佐剂,能够显著提高机体的体液免疫和细胞免疫应答水平。

摘要: 为了探讨人源miR-185对恶性疟原虫var(pfl1955w)基因表达调控并观察感染红细胞粘附所受到的影响,体外培养293T细胞和恶性疟原虫3D7,构建双荧光素酶报告质粒和表达质粒,再分别利用Lipofectamine 2000转染293T细胞和Cytomix电转恶性疟原虫3D7,流式细胞仪检测转染效率,用双荧光素酶报告验证人源miR-185对var(pfl1955w)的dbl区域直接调控作用,Q-PCR检测var(pfl1955w)mRNA的表达,细胞粘附实验检测感染红细胞的粘附。结果显示,293T细胞和3D7的转染效率在50%以上,过表达人源miR-185可显著抑制含var(pfl1955w)dbl的荧光素酶基因的表达;在293T细胞和3D7中,人源miR-185能够减少var(pfl1955w)mRNA的含量,并使感染红细胞粘附作用下降了39%。结果表明,人源miR-185对疟原虫var(pfl1955w)基因表达有下调作用,进而影响恶性疟原虫的粘附。

摘要: 为了获得恶性疟原虫红细胞内期不同生长阶段更加精准的组织材料,本研究探索一种简便易行并能获得同步化程度很高的恶性疟原虫虫株的方法。该方法采用山梨醇多次连续同步化恶性疟原虫环状体,并继续培养得到同步化程度高、窗口小、虫血率高的红细胞内期各期的恶性疟原虫虫株;室温条件下（17～20℃）继续培养同步化至裂成熟殖体期的恶性疟原虫虫株,用孔径1.2μm的无菌滤膜过滤,收集裂殖子。经同步化处理之后,恶性疟原虫在环期、早期滋养体期、晚期滋养体期和成熟裂殖体期的同步化程度分别在90%、85%、85%和80%以上,同步化后各期恶性疟原虫虫血率可达10%²0%,各期虫株的生长周期的窗口可达4 h以内。