摘要: 本研究以微小隐孢子虫甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Cryptosporidium parvum glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, CpGAPDH)为对象，研究其亚细胞定位和酶动力学特征。设计特异性抗原多肽并免疫家兔，获得多克隆抗体，利用亲和纯化法获特异性抗体；经Western blot方法验证该抗体特异性，再通过间接免疫荧光法(IFA)进行蛋白定位。通过原核表达获得GST重组蛋白(GST-CpGAPDH),基于GAPDH的酶促反应利用辅酶NAD(H)或NADP(H)为电子受体或供体的原理，通过吸光度比色法监测反应中NAD(H)/NADP(H)的增加或减少鉴定其酶活性。结果显示，成功获得并纯化抗CpGAPDH抗体；Western blot分析显示该抗体可识别条带大小为40 kDa; IFA结果表明该蛋白主要分布于子孢子胞浆内，部分呈现颗粒状。利用重组蛋白确定了CpGAPDH的酶活性；在两种辅酶中，CpGAPDH更倾向于使用NAD(H)进行酶活反应。结果表明，本研究确定了CpGAPDH在虫体细胞的定位及酶活性检测，为进一步研究其生物学功能奠定了基础。

摘要: 将微小隐孢子虫Cpgp4015基因定向克隆到真核表达载体pVAX1中多克隆位点XbaⅠ和PstⅠ之间,经酶切鉴定,构建真核表达重组质粒pVAX1-Cpgp4015,用脂质体介导法将其转染Hela细胞,并用G418加压筛选,后经SDSPAGE和Westernblot方法检测外源基因Cpgp4015的表达情况,得到预期大小的蛋白带,表明该重组质粒能够在哺乳动物细胞中较好地表达。

摘要: 目的 探究微小隐孢子虫氨基酸转运蛋白的亚细胞定位。方法 本研究以微小隐孢子虫氨基酸转运蛋白1(Cryptosporidium parvum Amino acid transporter 1, CpAAT1)为研究对象，设计合成了特异性多肽片段，免疫家兔制备多克隆抗体。利用Western blot验证该抗体的特异性，通过间接免疫荧光的方法对该蛋白的亚细胞定位进行了分析。结果 CpAAT1多克隆抗体能特异性识别虫体天然蛋白，后者在微小隐孢子虫生活史的各个时期均有表达。子孢子时期，CpAAT1定位于虫体表膜；无性生殖期时该蛋白定位在成熟的裂殖子表膜；在有性生殖阶段，雌雄配子体均可被该抗体标记。结论 本研究为进一步探索微小隐孢子虫氨基酸转运蛋白的转运机制提供了一些新线索。

摘要: 目的 本研究以微小隐孢子虫含有纤维连接蛋白Ⅲ型结构域蛋白（Cryptosporidium parvum fibronectin typeⅢdomain-containing protein, CpFN3）为研究对象，研究其亚细胞定位和黏附特性。方法 该蛋白由cgd4＿640基因编码、全长为含有2 430个氨基酸的I型跨膜蛋白。设计特异性抗原多肽并免疫家兔，获得多克隆抗体，利用亲和纯化法获特异性抗体；经Western blot方法验证该抗体特异性，再通过间接免疫荧光法（IFA）进行蛋白定位。通过原核表达获得重组蛋白（His-CpFN3）,通过ELISA确定重组蛋白与HCT-8细胞和肝素的结合情况。结果 成功获得纯化的抗CpFN3抗体，Western blot分析显示该抗体可识别条带大小约为280 kDa; IFA结果表明该蛋白定位于子孢子的表膜，呈点状分布。该蛋白在子孢子入侵阶段及胞内无性繁殖和有性繁殖阶段均有表达。利用重组蛋白，确定了CpFN3能够与HCT-8细胞及肝素结合（结合常数K_d分别为0.23和1.21μmol/L）,并呈剂量依赖性和可饱和性。结论 本研究确定CpFN3参与了虫体与宿主细胞的黏附过程。

摘要: 目的 本研究旨在阐明微小隐孢子虫亲环蛋白CpCyP1（Cryptosporidium parvum cyclophilin protein-1）的亚细胞定位和酶动力学等特征，为进一步深入研究其生物学功能和探索抗虫药物靶点提供基础。方法 采用荧光定量qRT-PCR,对CpCyP1基因在隐孢子虫不同发育时期转录水平进行分析；通过原核表达系统获得带有His标签的CpCyP1重组蛋白（His-CpCyP1）,并用该蛋白免疫新西兰家兔以制备特异性抗血清，利用亲和层析技术纯化所得抗血清；通过Western blot检测子孢子中的CpCyP1蛋白表达，通过间接免疫荧光（IFA）技术确定CpCyP1在虫体内不同发育阶段的亚细胞定位；最后，通过吸光度比色法测定His-CpCyP1的肽基脯氨酰顺反异构酶（peptidyl-prolyl cis-trans isomerase, PPIase）活性，并评估环孢菌素A（cyclosporine A, CsA）对His-CpCyP1酶活性的影响。结果 CpCyP1基因在隐孢子虫的各个发育阶段均有转录，尤其在裂殖体和配子阶段表达量较高；CpCyP1蛋白在子孢子和细胞内阶段均定位于虫体胞浆内。酶动力学研究显示，CpCyP1对含脯氨酸的短肽底物的米氏常数K_m为456.4μmol/L,最大反应速率V_max为1.981 U[μmol/（min·μg）]。CsA与CpCyP1结合的解离常数K_d为5.122μmol/L,半数抑制浓度IC₅₀为1.004μmol/L。结论 CpCyP1在隐孢子虫的各个发育阶段均有表达，并且重组的CpCyP1具有微摩尔级别的PPIase酶活性，该活性可以被CsA所抑制，这提示CpCyP1可能是CsA的潜在底物，因此，CpCyP1作为抗虫药物靶点的潜力值得进一步研究。