摘要: 【目的】东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae侵染蜜蜂导致微孢子虫病，但侵染机制未明。本研究拟在前期工作基础上，验证nce-miR-15325的相对表达量及序列信息，并进一步检测nce-miR-15325及其靶基因在东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂Apismelliferaligustica工蜂过程的相对表达量，为进一步探究nce-miR-15325调控侵染的功能和机制提供依据。【方法】利用Stem-loopRT-PCR和Sanger测序对nce-miR-15325进行相对表达量及序列信息验证。利用相关生物信息学软件对nce-miR-15325的靶基因进行信息预测及分析。通过RT-qPCR检测nce-miR-15325及其靶基因的相对表达量。【结果】鉴定到在东方蜜蜂微孢子虫孢子中nce-miR-15325真实存在并表达。预测到nce-miR-15325的11个靶基因，其中分别有3、4、7和4个靶基因可注释到KEGG、GO、Nr和Swissprot数据库。与接种后1 d相比，nce-miR-15325在2 dpi(day post inoculation, dpi)的表达量变化不显著，而在4、6和8 dpi时，相对表达量均显著下调（P<0.05），总体表达趋势呈下调。相较于1 dpi，靶基因NCSS在2、4、6和8 dpi的表达量均显著下调（P<0.05）；类似的，靶基因DTⅢ在2、4、6和8dpi的表达量均显著下调（P<0.05），总体上表现出下降的表达趋势。【结论】证实了东方蜜蜂微孢子虫孢子中nce-miR-15325存在和表达的真实性，明确了在东方蜜蜂微孢子虫侵染过程的nce-miR-15325及其靶基因的动态表达模式，揭示nce-miR-15325通过正调控NCSS和DTⅢ表达潜在调节侵染过程。

摘要: 【目的】中华蜜蜂囊状幼虫病毒（Chinese sacbrood virus,CSBV）和东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae都是严重威胁蜜蜂健康的重要病原，本研究旨在探究2种病原顺序感染对中华蜜蜂Apiscerana cerana存活率、营养代谢和免疫的影响。【方法】设置中华蜜蜂取食正常食物、先喂食CSBV后喂食东方蜜蜂微孢子虫和先喂食东方蜜蜂微孢子虫后喂食CSBV3个处理，利用PCR检测中华蜜蜂在取食第2天和第4天后体内病原增殖情况；通过RT-qPCR检测中华蜜蜂感染病原后第2天和第4天后体内CSBV数量以及营养代谢基因（ilp1、ilp2、hexamerin70b和hexamerin70c）和免疫应答基因（toll、relish、jra、apidaecin、abaecin、defensin、hymenoptaecin和JAK）的表达情况。【结果】先喂食CSBV后喂食东方蜜蜂微孢子虫组的中华蜜蜂体内孢子量高于先喂食东方蜜蜂微孢子虫后喂食CSBV组，而先喂食CSBV后喂食东方蜜蜂微孢子虫组的中华蜜蜂体内CSBV拷贝数显著高于先喂食东方蜜蜂微孢子虫后喂食CSBV组。先喂食CSBV后喂食东方蜜蜂微孢子虫组的中华蜜蜂营养代谢基因ilp1、ilp2、hexamerin70c和hexamerin70b的表达水平随感染时间延长逐渐呈现下调，而先喂食东方蜜蜂微孢子虫后喂食CSBV组中显著上调。先喂食CSBV后喂食东方蜜蜂微孢子虫组中华蜜峰免疫基因toll和relish表达量呈现先增加后下降，而jra、JAK、apidaecin、abaecin、defensin和hymenoptaecin的表达量显著增加，而先喂食东方蜜蜂微孢子虫后喂食CSBV组中8个免疫基因的表达量均显著增加。【结论】在顺序感染过程中，东方蜜蜂微孢子虫的感染抑制CSBV的增殖，而CSBV的感染则有助于东方蜜蜂微孢子虫的增殖。先喂食CSBV比先喂食东方蜜蜂微孢子虫对中华蜜蜂营养和生长发育的影响更显著，且更易引起宿主的免疫防御，表明CSBV与东方蜜蜂微孢子虫顺序感染中蜂后引起的免疫应答及营养代谢更为复杂。

摘要: 【目的】为探讨东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae感染蜜蜂后的形态学影响、各组织的感染情况及对中肠组织蛋白质的影响，初步探索蜜蜂自身免疫应答调控。【方法】分别提取中华蜜蜂/意大利蜜蜂实验组与对照组的蜜蜂中肠组织总蛋白，通过SDS-PAGE电泳技术筛选差异蛋白条带，LC-MS/MS质谱分析技术鉴定差异蛋白质，利用半定量和荧光定量RT-PCR技术验证筛选出的差异蛋白质。【结果】蜜蜂受东方蜜蜂微孢子虫感染后，中华蜜蜂Apis cerana cerana Fabricius和意大利蜜蜂Apis mellifera Ligustica的体重均未出现显著性差异，而二者受感染的中肠组织形态变化均较为明显。其次，对意大利蜜蜂而言，被筛选出的两条较明显的中肠差异表达蛋白质条带经质谱分析共鉴定到35个候选蛋白质。筛选出的两条中华蜜蜂中肠差异蛋白条带经质谱分析技术共鉴定到11个候选蛋白质。经验证，在感染N.ceranae后的第4天，筛选出的意大利蜜蜂精氨酸激酶（AK）和甘油三磷酸脱氢酶（GPDH）及中华蜜蜂硫氧还原蛋白还原酶（TrxR）及精氨酸激酶（AK）的蛋白表达量分别是对照组的2.02倍、2.21倍、1.72倍和1.88倍，均呈现上调表达，与蛋白质差异表达趋势一致。【结论】在东方蜜蜂微孢子虫感染意大利蜜蜂或中华蜜蜂后，筛选获得差异表达的蛋白质条带并进行鉴定。其中与蜜蜂中肠组织基本代谢、免疫应答、氧化应激与能量代谢相关蛋白质（如意大利蜜蜂的AK和GPDH、中华蜜蜂的AK和TrxR）的表达量被显著上调，暗示这些差异蛋白可能参与了蜜蜂中肠组织的免疫防御。本研究为深入探讨蜜蜂中肠对蜜蜂微孢子虫的免疫与代谢应答方式提供了丰富的数据基础。

摘要: 【目的】东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae是一种专性侵染成年蜜蜂中肠上皮细胞的单细胞真菌病原，广泛感染世界各地的蜂群。本研究拟利用已获得的东方蜜蜂微孢子虫纯净孢子的高质量转录组数据进行单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism,SNP）和插入缺失（Insertion-Deletion,InDel）位点的鉴定和分析，旨在丰富东方蜜蜂微孢子虫的SNP和InDel信息，并为新型分子标记的开发提供基础。【方法】使用GATK软件识别东方蜜蜂微孢子虫的SNP和InDel位点。采用SnpEff软件预测变异位点发生的基因组区域及变异产生的影响。通过相关生物信息学软件分别将SNP和InDel位点所在基因分别比对GO和KEGG数据库，获得相应的功能和通路注释。【结果】共鉴定到28195个SNP位点，其中发生转换和颠换的SNP位点分别有21403和6792个；上述SNP位点的突变类型有12种，其中最丰富的突变类型为C/T；分布在CDS区的SNP位点最多，其次是基因间区、上游区、下游区和内含子区；最丰富的密码子突变类型是同义突变；SNP位点所在基因可注释到代谢进程、细胞组分和催化活性等43个GO条目以及代谢途径、核糖体和等次生代谢产物的生物合成等85条KEGG通路。共鉴定到2831个InDel位点，其中分布在基因间区InDel位点最多，分布在CDS区的InDel位点最少；最丰富的密码子突变类型是移码突变；InDel位点所在基因可注释到细胞进程、细胞和结合等38个GO条目以及代谢途径、次生代谢产物的生物合成及核糖体等73条KEGG通路。【结论】东方蜜蜂微孢子虫中存在大量的SNP和InDel位点，SNP位点的突变类型主要为转换，与其他物种类似；SNP与InDel位点的基因组功能元件分布规律和突变类型具有明显差异；SNP和InDel位点所在基因与东方蜜蜂微孢子虫适应宿主细胞内环境及病原增殖过程具有潜在关系。

摘要: 【目的】筛选出微孢子Paranosema locustae感染条件下东亚飞蝗Locusta migratoria实时定量PCR最适内参基因。【方法】本研究应用实时荧光定量PCR技术测定东亚飞蝗甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(Glyceralde-hyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)、18s核糖体RNA(18s RNA)、微管蛋白基因(Tubulin,TUB)、肌动蛋白基因(Actin,ACT)和延伸因子1基因(Elongation factor1,EF1)5个候选基因在3个微孢子浓度(1×104、1×106和1×108个孢子/头)感染12 d后的表达稳定性;应用ge Norm、Bestkeeper和Normfinder 3个软件综合分析5个内参基因的稳定性。【结果】ge Norm软件对5个内参基因在不同微孢子虫浓度感染下稳定性分析结果表明:18S基因稳定性最低,平均表达稳定性值M值最高为0.658 4,TUB基因稳定性最高,M值最低为0.278 4。Norm Finder软件分析在不同微孢子虫浓度感染下的5个内参基因的稳定值分别为0.152(EF1)、0.181(ACT)、0.212(TUB)、0.329(GAPDH)和0.395(18S),可知内参基因稳定性顺序为:EF1>ACT>TUB>GAPDH>18S。由Best Keeper软件分析表明5个候选内参基因的SD值均小于1.0,表达均较稳定。根据其变异系数值CV的大小可知,ACT基因最为稳定。【结论】综合3种软件分析结果,在不同微孢子虫浓度感染下,可选择的较为稳定的内参基因ACT、EF1和TUB基因作为相对定量的参照基因。