摘要: 【目的】本研究旨在初步明确家蚕微孢子虫Nosema bombycis海藻糖酶3(NbTre3)的功能,为家蚕Bombyx mori微粒子病的防治提供理论依据和线索。【方法】通过PCR扩增NbTre3,构建原核表达载体pET28a-NbTre3;经IPTG诱导在大肠杆菌Escherichia coli中表达重组蛋白NbTre3,Western blot检测目的蛋白;Ni柱亲和层析法对重组蛋白NbTre3进行纯化,用获得的NbTre3免疫新西兰兔制备多克隆抗体;利用间接免疫荧光技术对成熟家蚕微孢子虫中的NbTre3进行定位;qRT-PCR检测家蚕微孢子虫感染家蚕5龄起蚕后不同时间中肠中NbTre3的转录水平;通过分别注射siRNA-1, siRNA-2和siRNA-3进行RNAi,qRT-PCR检测RNAi后不同时间感染家蚕微孢子虫的家蚕5龄起蚕中肠中NbTre3和16S rRNA的转录水平。【结果】成功纯化并获得重组目的蛋白NbTre3,大小约为34 kD。免疫新西兰兔后,收集血清,纯化获得NbTre3多克隆抗体,经Western blot鉴定正确。间接免疫荧光结果显示NbTre3主要分布在成熟家蚕微孢子虫孢原质中。qRT-PCR结果表明,家蚕微孢子虫感染后6 h时家蚕5龄起蚕中肠中NbTre3的表达量最高;siRNA抑制NbTre3的表达后,家蚕微孢子虫16S rRNA的转录水平没有明显的变化。【结论】结果提示NbTre3可能在家蚕微孢子虫感染初期的发芽过程中发挥重要的作用。

摘要: 【目的】本研究旨在通过差异表达基因(differentially expressed gene, DEG)分析以及毒力因子和其他侵染相关因子分析,在转录组水平揭示东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae侵染意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica的分子机制。【方法】基于前期已获得高质量的东方蜜蜂微孢子虫纯化孢子(NcCK)及侵染意大利蜜蜂工蜂7和10 d的东方蜜蜂微孢子虫(分别为NcT1和NcT2)转录组数据,根据P≤0.05且|log_2(Fold change)|≥1的标准,通过比较分析筛选出NcCK vs NcT1, NcCK vs NcT2和NcT1 vs NcT2比较组的DEG。通过相关生物信息学软件对上述DEG进行Venn分析、GO分类和KEGG代谢通路富集分析。根据Nr和KEGG数据库注释信息和相关文献进行对东方蜜蜂微孢子虫的毒力因子和侵染相关因子的统计和分析。通过RT-qPCR验证转录组数据及DEG表达趋势。【结果】从NcCK vs NcT1, NcCK vs NcT2和NcT1 vs NcT2比较组分别鉴定出1 397, 1 497和52个DEG。Venn分析结果显示各比较组共有的上调和下调基因分别为10和1个。GO分类结果显示,NcCK vs NcT1和NcCK vs NcT2中DEG富集数最多的功能条目为代谢进程、细胞进程、单组织进程、细胞、细胞组件、细胞器、催化活性和结合,而NcT1 vs NcT2中DEG富集数最多的是代谢进程、细胞进程、单组织进程、催化活性和结合。KEGG代谢通路富集分析结果显示,NcCK vs NcT1和NcCK vs NcT2中DEG分别富集到80和79条通路;富集在糖酵解/糖异生和MAPK信号通路的上调基因数量多于下调基因。毒力因子分析结果显示,孢壁蛋白9基因和孢壁蛋白12基因在NcCK vs NcT1和NcCK vs NcT2中均下调表达,孢壁蛋白8基因仅在NcCK vs NcT1中表达量下调;此外孢壁蛋白前体基因、孢壁和锚定盘复合蛋白基因、几丁质合酶基因、极管蛋白基因、蓖麻毒素B凝集素基因的表达水平在NcCK vs NcT1和NcCK vs NcT2中表现为上调。侵染相关因子分析结果表明,糖酵解途径的3个关键酶基因在NcCK vs NcT1和NcCK vs NcT2中上调表达;3个涉及ATP/ADP移位酶的基因在NcCK vs NcT1和NcCK vs NcT2中上调表达,但有1个表达量下调;2个涉及ABC转运蛋白的基因在NcCK vs NcT1和NcCK vs NcT2中上调表达,另有4个下调表达。RT-qPCR结果证实了本研究中转录组数据及DEG表达趋势的真实可靠性。【结论】本研究通过比较分析解析东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂工蜂过程的转录组动态,揭示了孢壁蛋白、孢壁和锚定盘复合蛋白、几丁质酶、极管蛋白和蓖麻毒素B凝集素等毒力因子编码基因,以及己糖激酶、丙酮酸激酶、6-磷酸果糖激酶、ATP/ADP移位酶和ABC转运蛋白等侵染相关因子编码基因在病原增殖中扮演重要角色,为阐明东方蜜蜂微孢子虫的侵染机制提供了基础。

摘要: 【目的】本研究旨在阐明家蚕微孢子虫Nosema bombycis感染不同时间对家蚕Bombyx mori幼虫不同组织中家蚕海龟蛋白(Bombyx Turtle, Bmtutl)基因表达水平的影响,为揭示家蚕微孢子虫的侵染机制奠定基础。【方法】利用生物信息学方法对家蚕海龟蛋白3种亚型Bmtutl-464, Bmtutl-519和Bmtutl-810的序列结构特征进行了分析;利用qPCR检测家蚕微孢子虫感染后12, 24, 48, 72, 96和120 h,家蚕幼虫中肠、血淋巴与脂肪体组织中Bmtutl-464,Bmtutl-519和Bmtutl-810基因表达水平的变化情况。【结果】家蚕海龟蛋白3种亚型的二级结构均主要由无规则卷曲、α螺旋、β转角和延伸链组成,其中无规则卷曲所占比例最高。但是PredictProtein分析发现,Bmtutl-464, Bmtutl-519和Bmtutl-810之间的蛋白/多核苷酸结合位点存在较大差异。qPCR结果表明,感染家蚕微孢子虫后,家蚕幼虫中肠、血淋巴与脂肪体组织中Bmtutl-464,Bmtutl-519和Bmtutl-810基因的整体表达处于被抑制状态,尤其在脂肪体中最为明显:Bmtutl-519和Bmtutl-810基因的表达在家蚕微孢子虫感染家蚕后的72 h开始受到显著抑制,特别是Bmtutl-519基因,其相对表达水平均不到对照的5.0%。【结论】家蚕海龟蛋白这3种亚型的序列结构特征存在较大差异,家蚕微孢子虫感染在一定程度抑制了家蚕幼虫中肠、血淋巴与脂肪体组织中Bmtutl-464,Bmtutl-519和Bmtutl-810基因尤其是Bmtutl-519的表达。结果说明,与其他两种家蚕海龟蛋白亚型相比,Bmtutl-519蛋白可能在家蚕微孢子虫侵染宿主的过程中起主要作用。

摘要: 【目的】以西方蜜蜂Apis mellifera工蜂肠道为例探究组织透明化技术——丙烯酰胺交联替换脂质透明硬化成像/免疫染色/原位杂交兼容组织水凝胶(clear lipid-exchanged acrylamide-hybridized rigid imaging/immunostaining/in situ hybridization-compatible tissue-hYdrogel, CLARITY)在昆虫组织上的应用,确定CLARITY与荧光原位杂交(FISH)相结合在昆虫肠道组织透明化中的适用性。【方法】依照CLARITY技术操作程序,用水凝胶固定西方蜜蜂肠道,并以被动方式透明化,再用靶向东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae 16S rRNA带异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)标记和靶向真核细胞18S rRNA带Texas RED标记的寡核苷酸荧光探针进行肠道组织的荧光原位杂交,然后用DAPI(蓝色)进行细胞核复染,通过激光共聚焦显微镜观察透明化的染色组织。【结果】首次成功将西方蜜蜂肠道组织透明化。在激光共聚焦显微镜下,观察到马氏管的原始分布形态,以及东方蜜蜂微孢子虫在中肠末端分布更密集的空间分布特征,并实现了对肠道组织的3D重构。【结论】CLARITY能应用于蜜蜂肠道组织透明化,透明化组织能进行原位杂交和激光共聚焦观察。CLARITY和FISH相结合免除抗体制备和石蜡切片的麻烦,直观展示肠道内部的真实状态,为昆虫生理病理研究提供了一种可靠特异的标记方法。

摘要: [目的]柞蚕微孢子虫Nosema pernyi引发柞蚕Antheraea pernyi微粒子病,威胁柞蚕种质资源的保育及生产安全,并且能够经卵垂直传播,因此需要寻找柞蚕体内应对柞蚕微孢子虫侵染后的免疫基因,为后续寻找和培育抗微粒子病新品种提供帮助。[方法]构建柞蚕微孢子虫侵染后柞蚕卵转录组,进行GO和KEGG分析确定免疫相关基因;PCR克隆柞蚕谷胱甘肽S-转移酶(glutathione Stransferases,GST)基因ApGSTo1并进行生物信息学分析;运用RT-qPCR检测ApGSTo1在柞蚕微孢子虫侵染后柞蚕产卵后0-10 d卵中的表达量。[结果]在感染与未感染柞蚕微孢子虫柞蚕卵转录组检测到的表达基因数为17 453,其中显著差异表达基因数目为89个,GO分类中细胞解剖实体和催化活性的基因数量最多,KEGG分析中参与运输和分解代谢、信号转导和消化系统这3个通路的基因数量最多。基于柞蚕微孢子虫侵染后柞蚕卵转录组数据分析,将ApGSTo1作为目的基因,PCR克隆及系统进化分析结果证明ApGSTo1属于GST的Omega家族;感染柞蚕微孢子虫柞蚕卵中ApGSTo1表达量比正常对照组的高,且在产卵后2 d时的表达量极显著高于正常对照组的。[结论]获得了柞蚕微孢子虫侵染后柞蚕卵转录组数据,找到了1个免疫相关基因ApGSTo1,从分子生物学和转录水平初步证明了ApGSTo1参与柞蚕卵内的抗柞蚕微孢子虫侵染,还发现了抗柞蚕微孢子虫侵染反应的关键时间为产卵后2 d时,为后续研究ApGSTo1在抗逆性和氧化还原等功能方面提供研究基础。