摘要: 【目的】本研究旨在系统鉴定和分析西方蜜蜂Apis mellifera肽聚糖识别蛋白（peptidoglycan recognition protein, PGRP）相关基因及其剪接异构体，探析PGRP基因剪接异构体编码蛋白的理化性质和分子特征，并测定PGRP基因剪接异构体在西方蜜蜂工蜂成虫应答东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae侵染中的表达模式，以期为西方蜜蜂PGRP基因剪接异构体的功能研究提供参考和依据。【方法】基于已获得的西方蜜蜂8和11日龄工蜂成虫中肠纳米孔测序数据，利用Blast工具将前期鉴定到的所有全长转录本分别比对到Nr和KEGG数据库，筛选出西方蜜蜂PGRP基因及其剪接异构体，并随机选择PGRP基因的5条剪接异构体通过RT-PCR验证序列的真实性。使用Gffcompare软件将鉴定到的PGRP基因序列比对至西方蜜蜂参考基因组以优化基因结构。采用Astalavista软件鉴定PGRP基因的可变剪接（alternative splicing, AS）事件类型，再通过RT-PCR和Sanger测序验证AS事件。利用相关软件预测和分析PGRP基因剪接异构体编码蛋白的理化性质和分子特征。采用RT-qPCR检测东方蜜蜂微孢子虫接种后西方蜜蜂工蜂成虫中肠中PGRP基因剪接异构体的相对表达量。【结果】共鉴定到西方蜜蜂的4个PGRP相关基因（PGRP-3,PGRP-S2,PGRP-LC和PGRP-LB）及其19条剪接异构体。通过RT-PCR与Sanger测序证实了PGRP基因5条剪接异构体（rna14029, ONT.6350.8, ONT.6350.10, rna24089和ONT.6350.7）的表达和序列真实性。PGRP-3（gene10434）的5′和3′端分别延长了8和1 055 bp,PGRP-S2（gene10435）的5′和3′端分别延长了27和234 bp。通过RT-PCR证实了PGRP-S2的AS事件的真实性。剪接异构体ONT.6350.2编码蛋白的分子式为C₉₆₆H₁₅₀₂N₂₇₂O₂₇₅S₇,分子量约为21 527.63 D,理论等电点为8.94,平均亲水性为-0.119,含有信号肽和PGRP结构域，不含跨膜结构域；剪接异构体ONT.6350.6编码蛋白分子式为C₈₄₁H₁₃₀₁N₂₄₃O₂₄₄S₅,分子量约为18 860.46 D,理论等电点9.14,平均亲水性为-0.324,不含跨膜结构域和信号肽。西方蜜蜂与东方蜜蜂A.cerana的PGRP-S2在进化树上聚为一支。相较于未接种东方蜜蜂微孢子虫的对照组，接种东方蜜蜂微孢子虫的西方蜜蜂工蜂成虫中肠中剪接异构体ONT.6350.2的表达量在接种后2和4 d时显著上调，在接种后3 d时极显著上调；剪接异构体ONT.6350.6与ONT.6350.2的表达模式相同；剪接异构体ONT.6350.2和ONT.6350.6在接种东方蜜蜂微孢子虫后1-4 d时总体上均表现为上升表达趋势。【结论】本研究优化了西方蜜蜂参考基因组上已注释的PGRP-3和PGRP-S2基因结构；揭示剪接异构体ONT.6350.2的编码蛋白可能是分泌蛋白，而剪接异构体ONT.6350.6的编码蛋白可能是胞内蛋白；西方蜜蜂与东方蜜蜂的PGRP-S2同源性最高；剪接异构体ONT.6350.2和ONT.6350.6在西方蜜蜂工蜂成虫应答东方蜜蜂微孢子虫侵染中被激活表达。

摘要: 【目的】本研究旨在克隆东方蜜蜂Apis cerana基质金属蛋白酶14（matrix metalloproteinase-14, MMP14）基因AcMMP14,分析其分子特征和表达模式，为持续深入开展AcMMP14的功能研究提供参考和依据。【方法】提取东方蜜蜂6日龄工蜂幼虫肠道总RNA,PCR扩增AcMMP14的编码序列（coding sequence, CDS）。使用相关生物信息学软件预测AcMMP14的理化性质和分子特征，鉴定东方蜜蜂和其他蜂种MMP14的结构域和保守基序，并进行系统进化分析。采用RT-qPCR检测AcMMP14在工蜂卵、幼虫、预蛹、蛹和不同日龄成虫，工蜂成虫触角、脑、表皮、脂肪体、毒腺、中肠和咽下腺及东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae接种刚出房的1日龄工蜂后1-4 d时中肠中的相对表达量。【结果】AcMMP14的分子式为C₃₀₆₈H₄₅₈₁N₈₀₃O₉₁₅S₂₀,分子量约为68.00 kD,脂溶系数为64.12,等电点为5.85,平均亲水系数为-0.47,含1个信号肽和36个磷酸化位点，可同时定位于线粒体、细胞核和细胞质。东方蜜蜂与其他10种蜂的MMP14中均含有3个相同的结构域和5个相同的保守基序。东方蜜蜂与大蜜蜂A.dorsata的MMP14的氨基酸序列一致性达94.23%,且在进化树上聚为一支。AcMMP14在东方蜜蜂工蜂卵、3日龄幼虫、 1和2日龄预蛹及4日龄蛹中差异表达，在4日龄蛹中的表达量最高且显著高于3日龄幼虫和2日龄预蛹中的表达量。AcMMP14在不同日龄工蜂成虫体内差异表达，在15日龄成虫体内的表达量最高且显著高于1, 2, 6, 12和17日龄成虫体内的表达量。AcMMP14在东方蜜蜂工蜂成虫的7种不同组织中差异表达，在触角中的表达量最高且显著高于脑、表皮、脂肪体、毒腺、中肠和咽下腺中的表达量。与未接种的对照组相比，东方蜜蜂微孢子虫接种后1和2 d时工蜂成虫中肠中AcMMP14的表达量显著下调，3和4 d时工蜂成虫中肠中AcMMP14的表达量下调但差异不显著。【结论】AcMMP14为潜在的亲水性蛋白和分泌蛋白；AcMMP14在东方蜜蜂工蜂不同发育阶段和成虫组织中发挥潜在的重要功能；工蜂成虫中肠中AcMMP14在东方蜜蜂微孢子虫的第一个增殖周期前期被激活表达。

摘要: 【目的】本研究旨在为深入开展西方蜜蜂Apis mellifera caspase-3基因（Am-caspase-3）的功能研究提供参考和依据。【方法】通过PCR扩增Am-caspase-3的编码序列（Coding sequences,CDS）后进行Sanger测序验证，并利用生物信息学工具预测Am-caspase-3蛋白的理化性质、分子特征及蛋白互作网络。利用MEGA软件进行西方蜜蜂和其他物种caspase-3系统进化分析。采用RT-qPCR检测Am-caspase-3在不同组织和发育阶段，工蜂成虫应答东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae侵染过程以及工蜂幼虫应答蜜蜂球囊菌Ascosphaera apis侵染过程中的相对表达量。【结果】Am-caspase-3的CDS长度为1 023 bp，编码340个氨基酸。Am-caspase-3的分子式为C₁₇₆₀H₂₇₀₃N₄₅₉O₅₃₉S₂₃，相对分子量为39 kD，不含跨膜结构域和信号肽区，但包含44个磷酸化位点，主要分布于细胞质。Am-caspase-3的二级结构包括184条无规则卷曲，90个α-螺旋，46条延伸链和20个β-转角。在Am-caspase-3中鉴定到1个结构域和3个保守基序；Am-caspase-3与其模版1m72.1.A之间的同源性达73.00%。Am-caspase-3与CytC等12个蛋白构成1个互作网络。西方蜜蜂与东方蜜蜂Apis cerana的caspase-3之间同源性达81.23%，在进化树上聚为一支。Am-caspase-3在西方蜜蜂工蜂不同组织中差异表达，在中肠中的表达量最高且极显著高于其他6个组织（P<0.01）。Am-caspase-3在3日龄幼虫中的表达量达峰值且极显著高于卵、7-8日龄预蛹及12日龄蛹（P<0.01）。Am-caspase-3在2、6、15和18日龄成虫体内的表达量显著高于1日龄成虫体内的表达量（P<0.05）。Am-caspase-3在工蜂成虫应答东方蜜蜂微孢子虫侵染的1、4、7、10和13 d皆显著下调（P<0.05）,Am-caspase-3在工蜂幼虫应答蜜蜂球囊菌侵染的1、2和3 d均显著上调（P<0.05）。【结论】成功克隆到Am-caspase-3的CDS;Am-caspase-3是潜在的酸性蛋白、亲水性蛋白和胞内蛋白，与CytC等11个蛋白之间存在互作关系；西方蜜蜂与东方蜜蜂的caspase-3之间同源性最高；Am-caspase-3潜在参与西方蜜蜂工蜂不同组织和虫态的发育过程及宿主应答病原真菌侵染的过程。

摘要: 目的建立FMMU白化豚鼠脑炎微孢子虫病动物模型。方法动物分为免疫抑制组和非免疫抑制对照组两组。从患病兔分离纯化兔脑炎微孢子虫,豚鼠灌胃接种,免疫抑制剂组肌肉注射氢化可的松。粪便检查虫体,观察临床症状,光镜检查内脏组织病理学变化,电镜观察微孢子虫超微结构,评价FMMU白化豚鼠作为脑炎微孢子虫感染动物模型的可行性。结果免疫抑制豚鼠于感染后第3天检出原虫,比非免疫抑制豚鼠检出时间早1 d。免疫抑制豚鼠于第6天全部检出原虫,比对照组豚鼠早2 d。对照组豚鼠除少数有食欲下降和消瘦外,其余无症状。免疫抑制豚鼠感染后出现消瘦、腹水等症状,5只于感染后35 d出现神经症状和少尿、排尿痛苦等泌尿系统症状。造模后40 d免疫抑制豚鼠死亡率达25%。光镜观察发现主要在脑、肾、肝等内脏器官中存在局灶性淋巴上皮样肉芽肿病变。电镜观察表明脑炎微孢子虫具三层结构的孢子壁,孢子内部极管呈6圈螺旋排列。结论成功建立免疫抑制FMMU白化豚鼠脑炎微孢子虫感染模型,可作为动物及人类的急性脑炎微孢子虫病动物模型用于相关研究。

摘要: 核糖体RNA(rRNA)是一种理想的进化计时器,已广泛地应用于研究微生物的系统发育和进化关系。蜜蜂和熊蜂都被微孢子虫感染,关于蜜蜂和熊蜂微孢子虫rRNA基因研究主要有rRNA基因序列的测定分析、二级结构的研究和用rRNA基因检测诊断微孢子虫等。这些对蜜蜂和熊蜂微孢子虫系统发育的研究和微孢子虫的防治等具有重要的推动作用。