摘要: 应用ＰＣＲ技术，对弓形虫Ｂ１基因的部分序列进行体外扩增，获得２０７ｂｐ的特异性核酸片段，并通过地高辛配基（Ｄｉｇ－１１－ｄＵＴＰ）标记作为探针，通过斑点杂交试验检测弓形虫核酸。实验表明，该探针能与ＲＨ、ＳＨ１、ＺＳ１、ＺＳ２及ＧＬ１株弓形虫核酸特异性杂交，最低检测量为２５ｐｇ纯化弓形虫核酸。在急性感染弓形虫的小鼠，该探针可于感染后第２天（２４ｈ后），从组织（肝、脾、及肾）中检测到弓形虫核酸，第３天（４８ｈ后）可从部分小鼠（１／５）外周血中检测到弓形虫核酸。表明该探针具有特异、敏感、快速、实用的特点，可望用于弓形虫病的早期诊断，适用于基层及流行病学调查。

摘要: 弓形虫表面抗原1(Surface antigen 1, SAG1)是虫体入侵宿主细胞的重要蛋白,与弓形虫的毒力密切相关,属于弓形虫病诊断和疫苗研究的重要候选分子。本研究表达了弓形虫RH株重组SAG1(Recombinant SAG1, rSAG1)蛋白并免疫双峰驼,分离、提取外周血淋巴单核细胞总RNA,以巢式PCR扩增骆驼重链抗体可变区(VHH),并将其连接至pHEN4载体,构建了SAG1噬菌体纳米抗体库,库容量为3.24×10～9cfu/mL,克隆阳性率90%。二轮淘选后富集因子为3.75×10～3。随机挑选40个阳性克隆测序,VHH基因编码的氨基酸序列同源性比对分析发现8个phage-ELISA值比较高的阳性克隆聚为3类。亚克隆至pMECS原核表达载体体外表达、纯化后获得8个大小约17 kDa的Anti-SAG1-Nb。免疫印迹结果显示Anti-SAG1-Nb-5能够与弓形虫天然抗原反应并产生明显的特异性条带。生物膜干涉法进一步获得该纳米抗体与SAG1的亲和常数为1.66 nmol/L。本研究首次构建了弓形虫SAG1纳米抗体库,淘选、制备并鉴定了8个Anti-SAG1-Nb,为弓形虫感染的早期检测试剂研制奠定了基础。

摘要: 构建弓形虫致密颗粒蛋白14(GRA14)的真核表达质粒,研究其对小鼠的免疫保护力。扩增弓形虫RH强毒株gra14基因并构建p VAX1-gra14真核表达质粒,免疫BALB/c小鼠。60只小鼠随机分成4组,实验组小鼠肌肉注射100μg p VAX1-gra14质粒,对照组分别注射PBS(100μL/只)和p VAX1空质粒(100μg/只),空白对照不作处理。共免疫3次,每次间隔14 d。ELISA法检测免疫后Ig G、亚型抗体和细胞因子水平。攻击实验后比较小鼠生存率,分析p VAX1-gra14的免疫保护作用。结果显示成功扩增gra14基因并构建真核表达载体,Western blot结果显示目的基因成功表达并具有反应原性,p VAX1-gra14免疫后小鼠的Ig G抗体水平显著升高,IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10的表达量分别为652.47±14.55、455.53±7.88、228.13±14.51和252.13±14.20 pg/m L,同时免疫后实验组小鼠的生存时间相比对照组显著延长,平均生存时间为14.1±1.3 d。以上结果表明,p VAX1-gra14能够诱导特异细胞免疫和体液免疫反应,产生一定的免疫保护作用。

摘要: 弓形虫感染可激发宿主产生Th1型免疫反应,因此研究弓形虫疫苗尤其需要关注系统性T细胞免疫应答与保护力的关系。本研究被弓形虫Pru株包囊口服感染BALB/c小鼠,成功建立了弓形虫慢性感染小鼠模型。慢性感染小鼠的脾细胞用弓形虫可溶性抗原刺激后可以产生特异性增殖。进一步分析发现弓形虫特异性CD3+T、CD4+T和CD8+T细胞都可以产生IFN-γ。本研究建立的弓形虫慢性感染小鼠模型可以产生较强的系统性T细胞免疫应答,为弓形虫疫苗研制的效果评价提供重要参考。

摘要: DNA疫苗是将编码抗原的基因插入载体质粒中构成重组体,直接接种机体,在接种部位摄取表达并达到抗感染目的的一种疫苗。p CMV-Taq2B载体具有人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus,CMV)高效启动子/增强子序列,可使目的基因在真核细胞中高水平稳定表达成为DNA疫苗载体。构建p CMV-Taq2BSurface antigen 2(表面膜抗原2)(p SAG2)、p CMV-Taq2B-Dense granule protein 2(致密颗粒蛋白2)(p GRA2)及p CMV-Taq2B-SAG2-GRA2(p SAG2-GRA2)DNA疫苗并研究其免疫保护效果。将p SAG2、p GRA2、p SAG2-GRA2 DNA疫苗(实验组)、磷酸盐缓冲液(Phosphate buffered saline,PBS)、p CMV-Taq2B空质粒(对照组)分别肌肉注射BALB/c小鼠,ELISA法检测血清Ig G抗体水平。末次免疫后第28 d,各组每只小鼠经腹腔注射弓形虫速殖子1 000个,观察小鼠的生存时间。结果显示单基因疫苗p SAG2、p GRA2和双基因疫苗p SAG2-GRA2免疫组均能诱导产生特异性Ig G抗体,且于末次免疫后第28 d达到最高值,此时单基因疫苗p GRA2(0.382±0.66)和双基因疫苗p SAG2-GRA2(0.548±0.137)免疫组吸光度值显著高于PBS(0.137±0.016)或p CMV-Taq2B(0.135±0.010)对照组吸光度值。免疫单基因疫苗p SAG2(14.3±1.8)、p GRA2组(13.5±2.1)小鼠存活时间(d)明显长于PBS(4.3±1.6)及p CMV-Taq2B组(4.1±1.3),且双基因疫苗p SAG2-GRA2组(19.6±2.4)小鼠存活时间明显长于单基因疫苗p SAG2组及p GRA2组。弓形虫双基因疫苗p SAG2-GRA2能够诱导小鼠产生抗弓形虫感染保护性免疫,其免疫保护性优于p SAG2、p GRA2单基因疫苗。