摘要: 为了研究尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)蛋白激酶C theta(PKCθ)和Spartin的蛋白表达情况,本实验在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达和提纯了尼罗罗非鱼PKCθ和Spartin的重组蛋白,并利用日本大耳兔(Oryctolagus cuniculus)制备了相应的多克隆抗体。用间接ELISA技术检测抗体效价,Western Blot鉴定抗体的特异性,并检测其在罗非鱼肝、脾、肠和肌肉组织中的表达情况。结果表明,实验成功构建了原核表达载体p ET-B2m-PKCθ和pET-B2m-Spartin,实现了重组蛋白的原核表达和纯化。PKCθ重组蛋白主要存在于包涵体中,分子量约为56 ku;Spartin重组蛋白分子量约为30 ku,以包涵体蛋白的形式存在。获得的多克隆抗体效价均高达1︰512 000,Western Blot检测结果表明,制备的抗体能特异性识别尼罗罗非鱼PKCθ和Spartin多种异构体;PKCθ蛋白在罗非鱼肝、脾、肠与肌肉组织中均有表达;Spartin蛋白在罗非鱼的肝、脾和肠组织中不表达,在肌肉组织中表达。研究表明,尼罗罗非鱼PKCθ和Spartin重组蛋白在大肠杆菌中成功表达,获得了高效价的多克隆抗体,并明确了尼罗罗非鱼PKCθ和Spartin在不同组织中的表达情况,为进一步研究尼罗罗非鱼PKCθ和Spartin的功能及其作用机制奠定了基础。

摘要: 采用扫描电镜观察了不同碱度(0、2、4 g/L Na HCO_3)胁迫对尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)鳃离子细胞形态变化的影响,并采用免疫组化技术观察了鳃、肾、肠中4个HCO_3-转运因子碳酸酐酶(CAⅡ、CAⅣ)、碳酸氢钠协同转运载体(SLC4A4)、Cl-/HCO_3-离子交换体(SLC26A6)的阳性反应变化。扫描电镜结果表明,鳃离子细胞分布在鳃小片基部。根据其表面开孔形状和尺寸,可分为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型和Ⅳ型4种亚型,各亚型离子细胞的开孔尺寸随碱度胁迫强度增高呈正比增大,Ⅲ型离子细胞开孔尺寸变化最明显(P<0.01);离子细胞总数目也随碱度升高而增加,Ⅲ型离子细胞数目上升最为显著(P<0.01)。免疫组化结果表明,在淡水、碱水组中,CAⅡ、CAⅣ、SLC4A4、SLC26A6在鳃小片基部和肾中均有阳性反应,且随着碱度升高,阳性反应增强,但在肠道中未观察到阳性反应。本研究结果初步表明,尼罗罗非鱼可通过鳃离子细胞形态和数量调节适应碱度变化,鳃和肾为主要应答调节器官。

摘要: 核糖体DNA内转录间隔区(internal transcribed spacers,ITS)是经常被用作种和种群水平系统研究的分子序列。本文分离了奥利亚罗非鱼(Oreochromis aureus)、尼罗罗非鱼(O.niloticus)内转录间隔区,包括部分18S序列,ITS1、5.8S、ITS2全序列及部分28S序列。4尾奥利亚罗非鱼的10个克隆序列分析表明,其存在长度不同的a、b两种类型ITS1。a型长为536 bp,GC含量为69.96%;b型长为520 bp,GC含量为69.04%69.42%。4尾尼罗罗非鱼的10个克隆序列分析表明,其只存在a型ITS1,长为536540 bp,GC含量为69.42%70.19%。与b型ITS1相比,a型ITS1在1631 nt有16 bp片段(GGCCCGCCTGCGGCGC)的插入。奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼共20条ITS序列中,5.8S长度均为157 bp,GC含量为56.69%57.96%;ITS2为408 bp,GC含量为72.79%74.26%。奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼ITS区序列相似性高达98.2%,表明这两种罗非鱼亲缘关系很近。此外,本文对14尾奥利亚罗非鱼、15尾尼罗罗非鱼以及15尾奥尼罗非鱼[O.aureus(♂)×O.niloticus(♀)]ITS1的扩增结果显示,奥利亚罗非鱼均有a、b两种类型ITS1;15尾尼罗罗非鱼中1尾为a、b两类型ITS1,14尾为a型ITS1;15尾奥尼罗非鱼中则有6尾具有a、b两类型ITS1,9尾为单一的a型ITS1。分析表明,奥利亚罗非鱼在ITS1这个位点一致性高,但尼罗罗非鱼中有1尾混杂了奥利亚罗非鱼的基因,同时也说明分子生物学手段应用于种质鉴定比形态学手段更为精确。

摘要: 采用离体细胞培养诱导方法,研究微囊藻毒素-LR(microcystin-LR,MC-LR)对尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)原代肝细胞的毒性效应。尼罗罗非鱼原代肝细胞经10、50、150、500μg/L MC-LR体外诱导24h后,单细胞微量凝胶电泳(SCGE)检测显示,与对照组相比处理组出现明显的彗星拖尾现象,说明MC-LR可引起尼罗罗非鱼肝细胞DNA的损伤,并随着剂量的增加,DNA的损伤程度增大。PI/Annexin V双染色流式细胞仪(FCM)检测表明MC-LR能明显引起肝细胞凋亡,与SCGE结果一致,且DNA损伤程度越大,细胞早期凋亡率越高,呈现明显的时间、剂量依赖性。本研究为进一步从分子、细胞水平阐明MC-LR的毒性以及致毒机理提供重要的理论依据。

摘要: 尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)雌雄鱼生长差异明显,为了探讨其原因,本文采用RT-PCR方法克隆了尼罗罗非鱼生长激素(Growthhormone,GH)及其受体(Growth hormone receptor,GHR)的cDNA序列,并应用半定量RT-PCR方法比较了雌、雄尼罗罗非鱼垂体GHmRNA、肝脏GHRmRNA、肌肉GHRmRNA的表达差异。序列分析表明:GH开放阅读框为615bp,共编码204个氨基酸;GHR开放阅读框为1908bp,共编码635个氨基酸。以RT-PCR方法研究了GH、GHR在各组织的分布情况,结果表明:GH仅在垂体中检测到有表达,而GHR在所检测的18种组织中均有表达,其中以肝脏、肌肉、性腺、下丘脑、胸腺表达量较高。以半定量RT-PCR方法进一步比较了雌、雄尼罗罗非鱼垂体GHmRNA、肝脏GHRmRNA、肌肉GHRmRNA的表达量,结果表明:雄鱼垂体GHmRNA和肝脏GHRmRNA的表达量均显著高于雌鱼,肌肉GHRmRNA的表达量则无显著差异,推测垂体GHmRNA和肝脏GHRmRNA表达的雌雄差异是尼罗罗非鱼雌雄生长差异的主要原因之一。