摘要: 目的探讨B6-Co小鼠出生时眼睑闭合不全的形成机制。方法分离、培养并鉴定B6-Co小鼠及其背景品系C57BL/6J(B6)眼睑成纤维细胞,CCK8法检测B6-Co、 B6小鼠眼睑成纤维细胞的增殖水平,Annexin V-FITC法检测B6-Co、B6小鼠眼睑成纤维细胞的凋亡水平,Transwell检测B6-Co、B6小鼠眼睑成纤维细胞的迁移能力。结果成功培养出B6-Co、B6小鼠眼睑成纤维细胞,B6-Co小鼠眼睑成纤维细胞的增殖能力和迁移能力极显著低于B6小鼠(P<0.01),B6-Co小鼠眼睑成纤维细胞的凋亡水平极显著高于B6小鼠(P<0.01)。结论 B6-Co小鼠眼睑成纤维细胞的增殖能力、凋亡水平及迁移能力均与B6小鼠有极显著差异。

摘要: 目的对Myh13基因敲除小鼠模型进行初步的表型分析,探讨Myh13的生物学功能。方法利用qRT-PCR和Western blotting技术检测小鼠中Myh13的表达情况;采用基因测序、q RT-PCR和Western blotting法验证Myh13敲除小鼠;统计杂合子小鼠自交产生的子代小鼠中各基因型比例;观察小鼠体质量变化趋势,并检测血液生化指标;对小鼠眼外肌进行HE染色和透射电子显微镜观察。结果在小鼠模型中,Myh13特异性高表达于眼外肌组织。经DNA、RNA和蛋白水平验证,Myh13敲除小鼠中目的基因成功剔除。杂合子小鼠子代中各基因型小鼠比例符合孟德尔遗传规律。Myh13敲除对小鼠的体质量、血生化指标无明显影响。HE染色结果提示,与野生型小鼠相比,杂合子和纯合子小鼠的眼外肌均无明显异常。电子显微镜下,杂合子和纯合子小鼠眼外肌中可见散在脂滴,并且纯合子小鼠还可见肌质网扩张的现象。结论 Myh13的敲除可改变小鼠眼外肌的微观结构,可能会影响眼外肌的功能。

摘要: 目的在建立既能保留人肿瘤生物学特性的,且免疫功能相对正常的人肿瘤异种移植动物模型的过程中,为保证小鼠脾淋巴细胞对人肿瘤细胞杀伤作用的考察效率,摸索建立基于流式细胞术的评价小鼠脾淋巴细胞对人HepG2细胞杀伤活性的方法。方法用羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯（CFSE）标记人HepG2细胞,利用无水乙醇模拟杀伤人HepG2细胞,用碘化丙啶（PI）染色,流式细胞仪检测,确定CFSE和PI的浓度及作用时间。以小鼠脾细胞为效应细胞,人HepG2细胞为靶细胞,从效靶作用时间和效靶比方面进行优化,确定试验方法的最佳条件。结果采用CFSE/PI双标记将细胞分为CFSE⁺PI-、CFSE⁺PI⁺、CFSE-PI⁺和CFSE-PI-4个组群,可有效区分活细胞和被杀伤细胞。CFSE标记靶细胞的浓度采用2.5μmol/mL,效靶作用时间为12 h,效靶比10∶1。结论建立了基于流式细胞术的评价小鼠脾淋巴细胞对人HepG2细胞杀伤活性的方法,该方法的建立可为评价动物脾淋巴细胞对异种细胞的杀伤作用提供参考。

摘要: 目的建立基于多重PCR靶向二代测序的小鼠遗传质量监测方案。方法从小鼠单核苷酸多态性(SNP)数据库筛选出相对均匀分布在20条染色体上的112个SNP位点,然后对SNP位点附近片段进行多重PCR扩增,建库后进行Illumina高通量测序,对原始测序数据进行生物信息学分析获得SNP信息。结果测序结果显示,多重PCR的扩增子均一性好,各片段成功率高达90%以上,特异性高,高深度测序条件下, SNP位点的等位基因比例趋近于1或0,符合纯合子条件;分析4批近交系小鼠样本,表明SNP位点成功鉴定的比例分别为99.82%, 92.00%, 99.10%和90.35%,且所有小鼠品系个体的SNP位点均为纯合,并被成功确定为目标品系;品系间两两比较,最大差异数为73个,最小差异数为3个,差异位点平均数为53个,差异中位数为60个,显示出本方案对常见近交系小鼠品系分辨率较高。结论多重PCR靶向二代测序方案的SNP分型方案是一种准确、快速、高效的基因分型方案,可用于遗传质量检测和品系鉴定。

摘要: 目的建立一种高效的C57BL/6J背景基因修饰小鼠的精子冷冻及体外受精(IVF)方法。方法以C57BL/6J小鼠为研究对象,围绕冷冻保护液、冷冻精子浓度、复苏后精子处理方法及IVF培养液等方面进行研究,IVF后2-细胞发育率作为冷冻和复苏效率评价标准,对比各组之间发育情况。结果以R18S3(含质量比为18%棉子糖和3%脱脂奶粉)、M-R18S3冷冻保护液[含终浓度为477μmol/L硫代甘油(MTG)的R18S3冷冻液]进行精子冷冻,复苏后在HTF培养液中进行IVF,2-细胞发育率分别为8.4%和20.6%;以R18S3和M-R18S3作为冷冻保护液,以含浓度为1 mmol/L还原性谷胱甘肽(GSH)的HTF培养液进行IVF,2-细胞发育率分别为25.0%和43.5%。高浓度精子冷冻及复苏法可获得64.2%的2-细胞发育率;选取4种C57BL/6J背景基因修饰小鼠进行精子冷冻及IVF,2-细胞发育率34%～90%,胚胎移植后出生率40%～57%。结论 M-R18S3作为冷冻保护液,采用高浓度精子冷冻法进行精子冷冻,冷冻精子复苏后进行受精滴洗涤筛选,以含1 mmol/L GSH的HTF培养液进行冷冻精子IVF,此技术体系可以作为C57BL/6J背景基因修饰鼠的保种及品系恢复手段。