摘要: 【目的】本研究旨在通过研究小菜蛾Plutella xylostella溶菌酶的功能,进一步认识小菜蛾的免疫防御机理,为小菜蛾的生物防治提供新的思路。【方法】利用RACE技术克隆小菜蛾溶菌酶基因。构建原核表达载体pET-29a-Pxlys,利用原核表达系统表达并用镍柱亲和层析纯化重组蛋白Pxlys。利用牛津杯法检测重组蛋白Pxlys对停滞棒杆菌Corynebacterium stationis、藤黄微球菌Micrococcus luteus、金黄色葡萄球菌Staphyloccocus aureus、大肠杆菌Escherichia coli、志贺氏菌Shigella sp.、沙门氏菌Salmonella sp.和苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis的抑菌活性,并利用扫描电子显微镜观察重组蛋白Pxlys对停滞棒杆菌和大肠杆菌的溶菌特征。【结果】克隆获得开放阅读框长423 bp的小菜蛾溶菌酶基因Pxlys(GenBank登录号:MN702780)序列,它编码140个氨基酸,相对分子质量为15.79 kD。抑菌试验表明,重组蛋白Pxlys不仅对革兰氏阳性细菌的停滞棒杆菌、藤黄微球菌和金黄色葡萄球菌有较强的抑菌活性(抑菌圈直径分别为20.0±1.1, 19.0±0.5和16.5±0.5 mm),而且对革兰氏阴性细菌大肠杆菌、志贺氏菌和沙门氏菌也有抑菌活性(抑菌圈直径分别为16.3±0.5, 15.0±0.5和14.0±1.1 mm),重组蛋白Pxlys对革兰氏阳性细菌比对革兰氏阴性细菌表现出更强的抑菌活性。另外,重组蛋白Pxlys还表现出对苏云金芽胞杆菌的抑菌活性。扫描电子显微镜下,经重组蛋白Pxlys处理过的停滞棒杆菌和大肠杆菌的溶菌特征不同。【结论】Pxlys具有广谱的抗微生物活性,其对革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌的抑菌机理可能存在不同。研究结果为深入研究小菜蛾免疫防御系统提供基础。

摘要: 【目的】Polycalin蛋白是一种新发现的Bt毒素受体,可能与昆虫对Bt的抗性有关。本研究旨在明确小菜蛾Plutella xylostella Polycalin蛋白与Bt Cry1Ac毒素的关系。【方法】本研究通过PCR结合RACE技术从小菜蛾3龄幼虫中肠克隆获得Polycalin蛋白基因的全长cDNA序列,采用实时定量PCR技术研究Polycalin蛋白在小菜蛾不同发育阶段、4龄幼虫不同组织及用不同浓度Cry1Ac毒素饲喂3龄幼虫后的表达量。提取小菜蛾幼虫中肠的刷状缘膜囊泡(BBMV),运用合成多肽的方法制备Polycalin蛋白抗体,利用Western blot和Ligand blot技术对小菜蛾Polycalin蛋白进行鉴定,分析其与Cry1Ac毒素的结合特性。【结果】克隆得到的小菜蛾Polycalin蛋白基因的cDNA序列全长为9 102 bp(GenBank登录号:MF138149),其中,开放阅读框为8 778 bp,编码2 925个氨基酸;预测蛋白质分子量为326.38 kD,等电点为4.39;在推导的氨基酸序列中,前20个氨基酸为N-末端信号肽序列,含有14个N-糖基化位点,67个O-糖基化位点,6个脂质运载蛋白特征序列,6个脂质运载蛋白位点和13个类脂质运载蛋白结构域,并且在第20和21位(TSG-QVV)氨基酸之间存在一个裂解位点,在C-末端存在2个GPI结合位点,具有Bt毒素受体的特征。该蛋白在幼虫期的表达量较高,尤其在3龄幼虫体内表达量最高,在蛹和成虫中的表达量最低;在4龄幼虫的头、胸、腹中均有表达,在幼虫腹部中的表达量最高;3龄幼虫取食不同浓度的Cry1Ac毒素后,Polycalin蛋白的表达量下降,且Cry1Ac毒素浓度越高,下降越明显。通过Western blot检测到小菜蛾中肠刷状缘膜囊泡(BBMV)上存在大约300 kD的Polycalin蛋白条带;Ligand blot实验证明了小菜蛾Polycalin蛋白能与Cry1Ac毒素结合。【结论】本研究首次初步明确了小菜蛾Polycalin蛋白具有与Bt毒素结合的特性,为研究Bt对昆虫的作用机理和利用Bt防治害虫提供一定的理论基础和参考价值。

摘要: 【目的】发现昆虫精巢干细胞自我更新相关基因3'UTR上的保守miRNA靶位点,为深入研究昆虫精子发生进程中的miRNA-基因调控关系提供参考。【方法】使用Blast搜索27种全变态昆虫精巢干细胞自我更新相关基因,并预测这些基因的3'UTR。使用Target Scan预测这些基因3'UTR上的miRNA靶位点。对家蚕Bombyx mori和小菜蛾Plutella xylostella的Chinmo和Imp基因包含let-7-5p靶标点的3'UTR序列进行了克隆,使用双荧光素酶报告系统对其靶标关系进行验证。【结果】在27种全变态昆虫中发现了17个精巢干细胞自我更新相关基因。利用Target Scan在这些基因的3'UTR上预测到了203个保守的miRNA靶位点。其中Zfh-1,Chinmo,Ken及Imp的3'UTR上存在大量的miRNA靶位点,但miRNA靶位点数目在不同昆虫类群中也存在很大差异。其中,Chinmo及Imp 3'UTR上的let-7-5p靶位点在昆虫中保守。分别克隆了家蚕和小菜蛾Chinmo和Imp的3'UTR,通过双荧光素酶报告系统转染239T细胞证实了let-7-5p对Chinmo和Imp两个基因的调控作用。【结论】发现在4个昆虫精巢干细胞自我更新相关基因Zfh-1,Chinmo,Ken和Imp的3'UTR上存在大量的miRNA靶标位点。其中Chinmo及Imp基因3'UTR上let-7-5p靶位点在大多数全变态昆虫中保守,双荧光素酶报告系统实验证实了家蚕和小菜蛾中let-7-5p与Chinmo和Imp存在相互作用,为进一步研究miRNA在昆虫精子发生进程中的功能提供了参考。

摘要: 【目的】本研究旨在克隆小菜蛾Plutella xylostella体内一种C型凝集素基因,检测其在小菜蛾体内的表达模式,并探讨该蛋白对细菌的凝集作用。【方法】基于对小菜蛾转录组和基因组进行生物信息学分析的基础上,RT-PCR结合RACE技术克隆小菜蛾C型凝集素基因全长cDNA序列。构建原核表达质粒载体,在大肠杆菌BL21中高效表达小菜蛾C型凝集素融合蛋白,利用纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔,获得了高效价的抗血清。利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测小菜蛾C型凝集素基因在小菜蛾不同发育时期(卵期、1-4龄幼虫、预蛹期、蛹期和成虫期)和小菜蛾4龄第1天幼虫不同组织(血细胞、表皮、脂肪体、中肠和马氏管)中的表达模式。RT-qPCR和Western blot检测小菜蛾C型凝集素基因在大肠杆菌和苏云金芽孢杆菌刺激下的表达差异。显微镜下观察重组蛋白对这两种细菌的体外凝集现象。【结果】克隆了小菜蛾型C型凝集素基因PxCTL5(GenBank登录号:KY807084),cDNA序列全长1 243 bp,开放阅读框(ORF)序列长672bp,编码223个氨基酸残基。RT-qPCR显示PxCTL5基因在小菜蛾各个龄期均有表达,在成虫期处于高水平表达;主要在表皮中表达,可被苏云金芽孢杆菌和大肠杆菌强烈诱导表达,表达高峰期分别为诱导后18 h和24 h。Western blot检测表明,经苏云金芽孢杆菌和大肠杆菌诱导后,小菜蛾血淋巴中PxCTL5蛋白表达量明显提高。体外凝集实验表明,在钙离子存在下,PxCTL5蛋白对两种细菌都有一定的凝集作用,对苏云金芽孢杆菌的凝集作用较强。【结论】小菜蛾PxCTL5可经细菌诱导表达,PxCTL5对苏云金芽孢杆菌有较强凝集作用。

摘要: 【目的】探讨小菜蛾Plutella xylostella成虫触角叶上细胞体的分布、数量及形态特征。【方法】通过细胞核染色和激光共聚焦显微镜对其触角叶结构进行分层扫描,然后利用Imaris软件进行图像分析,并构建细胞体的三维结构模型,测量其体积和表面积。【结果】小菜蛾的触角叶表面分布有大量的细胞体,细胞体成簇分布于触角叶的内侧、外侧和前端,有少量巨型不规则细胞体出现在触角叶内侧和外侧细胞体群中;雌性小菜蛾触角叶上大约有560个细胞体,雄蛾细胞体数量多于雌蛾,约810个。细胞体的形态差异较大,三维重建显示多数细胞体呈近球形。最小细胞体的表面积和体积分别为96.7μm2和76.9μm3,其对应细胞核表面积和体积分别为42.5μm2和24.1μm3。最大体细胞的表面积和体积分别为389μm2和514μm3,对应细胞核的表面积和体积分别为265μm2和261μm3。【结论】本研究阐明了小菜蛾触角叶上细胞体的分布和形态特征,为深入了解昆虫中枢神经系统的解剖结构和生理功能提供一定的基础。