摘要: 以未诱导组作为空白对照研究比较真菌诱导、超声诱导和热诱导家蝇Musca domestica幼虫血淋巴初提液的抗真菌肽效果,比较各种诱导方法诱导后的幼虫存活率;用凝胶层析法和高效液相分离纯化热诱导家蝇3龄幼虫抗真菌肽,检测其抗白假丝酵母菌Candida albicans和新生隐球菌Cryptococcus neoformans活性;SDS-PAGE分析抗真菌肽的蛋白分子量范围。结果表明:3种诱导方法诱导后家蝇幼虫均产生具有明显抗真菌作用的抗真菌肽,其初提液抑菌圈大小没有明显差别;真菌诱导组和热诱导组幼虫存活率低于对照组,而超声诱导组与对照组相比则无明显差别。经分离纯化后,抗真菌肽仍具有较好的抗真菌活性;SDS-PAGE分析表明该抗真菌肽有效成分的蛋白分子量在14.4kD以下。结果提示热诱导家蝇幼虫产生抗真菌肽是一种方便、有效的诱导方式。

摘要: 研究了家蝇Musca domestica幼虫提取物对辐射小鼠的免疫调节作用。测定了小鼠的脏器官指数,NK细胞活性,T、B淋巴细胞增值活性及小鼠血清SOD活性和MDA含量等指标。结果表明:经口给予一定剂量的家蝇幼虫提取物对辐射和未辐射小鼠的脾脏指数和胸腺指数变化有显著影响,均可提高NK细胞活性,T、B淋巴细胞增值活性及小鼠血清SOD活性,同时可降低小鼠血清中的MDA含量。结果显示家蝇幼虫提取物对辐射和未辐射小鼠均具有较好的免疫调节作用。

摘要: 攻击素(attacin)作为昆虫抗菌肽之一,在昆虫的先天免疫中起着重要作用。本研究通过家蝇Musca domesticaEST序列筛选并结合RACE技术克隆了家蝇的Attacin-2基因(Mdatta2)cDNA序列。其全长819 bp,包含一个726 bp的完整开放阅读框(open reading frame,ORF),以及42 bp的5'末端非翻译区(5'UTR)和51 bp的3'末端非翻译区(3'UTR),编码241个氨基酸残基,推导的多肽N端22个氨基酸残基为信号肽序列。同源性分析表明,其氨基酸序列与嗜凤梨果蝇Drosophila ananassae的Attacin一致性最高(46%)。以邻接法(Neighbor-Joining,NJ)构建的系统关系表明,家蝇的Attacin-2与其他双翅目昆虫的Attacin起源于共同的祖先,属于Attain_C超家族。应用实时荧光定量PCR的方法研究家蝇幼虫在受到外源细菌刺激时Mdatta2基因的表达,结果显示,在大肠杆菌Escherichia coli和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus分别刺激后3 h和6 h,家蝇幼虫Mdatta2表达量出现显著上调。Mdatta2基因在家蝇幼虫体内呈诱导型表达,表达水平随诱导时间的不同而变化,提示Mdatta2基因可能在家蝇免疫防御过程中起着重要作用。

摘要: 为了鉴定家蝇Musca domestica免疫相关基因,应用抑制性消减杂交技术,构建刺激家蝇幼虫差异表达cDNA消减文库。以大肠杆菌Escherichia coli和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus诱导12h的家蝇幼虫与未诱导的家蝇幼虫为消减杂交对象,获得了差异表达基因的cDNA片段,将其与T/A载体连接并转化大肠杆菌DH5α,构建了刺激家蝇幼虫cDNA消减文库。PCR检测发现,文库的阳性克隆中插入的cDNA片段大小在2001000bp之间,随机挑选了161个含大小不等差异片段的克隆进行测序和同源性分析,鉴定了36种蛋白的基因片段,包括抗菌肽、酶、核糖体蛋白、其他功能蛋白以及功能不明的蛋白。用半定量RT-PCR分析了其中6种蛋白基因的表达,结果显示:防御素和攻击素基因在细菌刺激后24h内明显上调表达,而溶菌酶、酚氧化酶原活化因子、糜蛋白酶和蛋白质合成起始因子基因在细菌刺激后0-4h内表达受抑制,12h后上调表达。该研究结果为家蝇免疫相关基因的克隆和家蝇免疫防御机制的探讨奠定了良好的基础。

摘要: 半胱氨酸蛋白酶抑制剂是具有抑制半胱氨酸蛋白酶活性的一类蛋白超家族。本研究根据EST序列信息,通过RACE技术克隆得到1条家蝇Musca domestica半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因MdCPI,该基因含有1个357bp开放阅读框,编码118个氨基酸残基,推导的多肽N端17个氨基酸残基为信号肽序列。同源分析表明,MdCPI氨基酸序列与红尾肉蝇Sarcophaga crassipalpis的CPI相似性最高(identity=51%)。以邻接法(NJ)构建的系统树表明,家蝇与其他双翅目昆虫CPI起源于共同的祖先,属于I25A型蛋白家族。为了解家蝇CPI对半胱氨酸蛋白酶的抑制活性,构建pET-17b-MdCPI表达载体,并转入大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)进行重组表达。研究发现1μg重组家蝇CPI能够抑制约14μg木瓜蛋白酶的水解活性。结果表明MdCPI确属CPI家族,可能同其他家族成员具有相似的功能,参与免疫及生理调控。这些结果为研究MdCPI在家蝇体内作用机制奠定了基础。