摘要: 为了优化甲醇萃取滞育家蝇Musca domestica幼虫血淋巴中抗病毒肽的方法,本实验分别比较甲醇及乙腈萃取血淋巴中抗病毒组分效果及最佳使用梯度、上样蛋白浓度、洗脱次数、洗脱流速及操作环境温度,用Tricine-SDS-PAGE分析甲醇及乙腈的洗脱组分的构成。结果表明:甲醇萃取的活性组分多于乙腈萃取的;用连续梯度(10%100%)甲醇萃取的抗病毒活性组分,比分别用10%,30%,50%,70%,90%和20%,40%,60%,80%,100%间断梯度洗脱的回收率高,同时获得活性组分的重现性好。在04℃冰浴的环境下,于250mg/6mLC18萃取柱内加入1.5±0.4mg/mL蛋白浓度的血淋巴粗提液,用1mL/min流速4次洗脱,抗病毒活性组分可以得到较好的分离效果。

摘要: 采用杀虫剂(溴氰菊酯和甲基嘧啶磷)筛选及不接触药物自然衰退的方法,研究了家蝇Musca domestica氯氟氰菊酯高抗品系(Cyh-R)对杀虫剂的抗性变化,探讨蝇类抗药性治理的方法。用点滴法测定氯氟氰菊酯对不同家蝇品系的毒力,比较抗药性的变化,结合特异性等位基因PCR扩增(PASA)技术检测了不同家蝇品系的kdr基因频率,探讨kdr基因频率与抗性水平之间的关系。结果表明:甲基嘧啶磷筛选后,氯氟氰菊酯对第28代Cyh-R品系的LD50呈递减趋势,从F0的2.8434μg/蝇降为F8的0.4404μg/蝇,但第818代Cyh-R品系的LD50呈逐代递增趋势;溴氰菊酯筛选后,氯氟氰菊酯对Cyh-R品系第216代的LD50呈上升趋势,从F0的2.8434μg/蝇升至F16的24.3249μg/蝇;表明了施用有机磷杀虫剂可降低其对氯氟氰菊酯的抗药性,而施用拟除虫菊酯药剂则有助于其对氯氟氰菊酯抗药性的增长;不使用任何杀虫剂也能降低其对氯氟氰菊酯的抗药性,但下降速率低于甲基嘧啶磷。PASA技术检测表明Cyh-R品系的kdr抗性基因频率为88.8%,不经过任何药剂筛选其kdr抗性基因频率下降程度最大,达到69.7%;甲基嘧啶磷筛选后其结果降为78.8%,而经溴氰菊酯筛选后kdr抗性基因频率则明显升高,达到98.9%。通过对kdr抗性基因频率和抗性水平进行相关和回归分析表明kdr抗性基因频率与家蝇对氯氟氰菊酯的LD呈对数关系,即LD值高的品系其kdr抗性基因频率相应的也较高。建议在家蝇防治中考虑轮换用药。

摘要: 卫矛是常见的绿化植物,而秋家蝇Musca autumnalis De Geer是畜牧业的重要昆虫。在室内利用Y型嗅觉仪对欧洲卫矛Euonymus europaeus和胶东卫矛E.kiautschovicus气味对秋家蝇Musca autumnalis De Geer的引诱效果进行了研究。结果表明:两种植物都对秋家蝇的雌性成虫有引诱作用,而欧洲卫矛引诱效果更好。进一步对叶和花的气味进行的观察表明,卫矛吸引秋家蝇主要依靠花的气味,但叶的气味也有一定的吸引作用;叶的气味对花的引诱效果有增效作用。利用几种试剂(水、乙醇和正己烷)对欧洲卫矛花的气味物质进行了抽提,测试结果表明水或乙醇抽提物比正己烷抽提物引诱效果更好;冷冻花与新鲜花的引诱效果没有显著的差异。

摘要: 泛素-蛋白酶体途径(ubiquitin-proteasome pathway)是具有高度选择性的蛋白质降解途径,该途径对细胞内蛋白的选择性降解起着重要作用。本研究根据GenBank已登录的真核生物泛素(ubiquitin)编码框的氨基酸序列,设计一对简并引物,RT-PCR克隆了家蝇Musca domestica泛素基因的编码区cDNA序列,并进行了测序。序列分析表明,该编码区的长度为228bp,编码76个氨基酸,命名为Mdubi,GenBank登录号为DQ115796。同源性比较发现,Mdubi氨基酸序列与其他真核生物泛素编码框同源性可达94%以上。RT-PCR检测表明,Mdubi在家蝇不同组织中均高效表达,且不受大肠杆菌Escherichia coli刺激的影响,是遍在性表达。为进一步研究Mdubi的结构和功能,将Mdubi克隆到原核表达载体pQE30上,构建重组质粒pQE30-UBI,转化大肠杆菌M15感受态细胞,在IPTG诱导下进行了高效表达,SDS-PAGE检测表明Mdubi在大肠杆菌中可表达相对分子质量为9.6kD的可溶性融合蛋白;Western blot分析表明表达产物能与Ni-NTA鏊合物特异性的结合,表明表达的Mdubi为N端带有6His标签的融合蛋白。利用Ni2+-NTA亲和柱一步纯化了Mdubi,以该融合蛋白免疫新西兰大白兔制备了抗Mdubi血清。本研究成功克隆了家蝇泛素的编码序列,并在原核细胞中得到了表达,为进一步研究泛素在家蝇体内的作用机制奠定了基础。

摘要: 通过体壁损伤和感染大肠杆菌同时诱导家蝇Musca domestica幼虫产生免疫血淋巴,经沸水浴热变性,透析浓缩处理,然后经Tricine-SDS-PAGE得到诱导前后家蝇幼虫血淋巴中蛋白差异表达条带,将该条带电泳回收,复性,抗菌活性检测等步骤,分离纯化得到抗菌肽MDL-2,其分子中富含Pro,Gly和碱性氨基酸,分子量为11kD,对革兰氏阴性菌Escherichia coli和革兰氏阳性菌Staphylococcus aureus均有较强抗性,因此电泳制备抗菌肽的方法为此类生物微量活性物质的分离纯化提供一种行之有效的途径。通过MDL-2对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌通透性和透射电镜超微结构的图谱分析,MDL-2首先与细菌的外膜结合,然后抗菌肽形成柔性的两亲空间构象与细胞内膜作用,扰乱了膜脂分子的排列,改变了细胞膜的通透性,影响细胞膜的结构和功能,细胞膜上形成了许多孔道,同时造成细胞内的原生质扩散,并从孔道向胞外渗漏,影响了细菌的代谢系统,最终引起细胞膜破碎,细胞完全解体,从而起到抑菌杀菌作用。