摘要: 对家蝇GNBP3基因进行克隆及生物信息学分析,并对该基因在感染白色念珠菌Candida albicans后的表达情况进行研究。从构建的家蝇Musca domestica幼虫c DNA质粒文库中筛选到GNBP3基因,克隆并运用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白进行预测和分析。白色念珠菌注射感染家蝇幼虫并收集标本,逆转录,通过荧光定量PCR检测感染样本中GNBP3基因的表达情况,结果进行统计学分析。研究结果表明,GNBP3基因ORF全长1473 bp,编码490个氨基酸,理论分子量为55.8 k Da,等电点为6.85;感染后不同时间点,感染组与对照组比较,在3 h、12 h、36 h、48 h GNBP3 mRNA的表达明显增高,两组比较有显著性差异(P<0.05),而24 h表达差异性最小;感染后不同组织中感染组与对照组比较,3 h和12 h时,在体壁、血淋巴、脂肪体中的表达量升高,具有显著性差异(P<0.05);24 h时,在血淋巴中的表达量较对照组高,而在唾液腺和脂肪体中的表达量呈下降趋势,均具有显著性差异(P<0.05);48 h,在血淋巴和脂肪体中表达量较对照组高,在中肠的表达量较对照组低,均具有显著性差异(P<0.01)。成功克隆GNBP3基因且在家蝇感染白色念珠菌后GNBP3的表达水平随时间的推移呈现先升高后降低再升高的趋势,在各组织中以在免疫组织(血淋巴、脂肪体)中的表达显著增高,推测其在真菌识别过程中发挥潜在作用。

摘要: 家蝇Musca domestica是一种重要的资源昆虫,作为饲料蛋白已广泛应用于动物养殖产业。MRJP1蛋白(Major Royal Jelly Proteins 1,MRJP1)是蜂王浆的主要蛋白成分,具有营养作用和跨物种促细胞增殖作用。构建表达意大利蜜蜂Apis mellifera王浆蛋白基因Ammrjp1的家蝇可望提高家蝇幼虫的应用价值。本研究构建了携带Ammrjp1基因的重组转座质粒p Bac[fa PUb-mrjp1-DsRed],显微注射家蝇胚胎,成功建立Ammrjp1转基因家蝇品系,RT-PCR证明Ammrjp1基因在转基因家蝇中正常转录;Southern Blot证实Ammrjp1基因是以单拷贝的形式插入到家蝇基因组内;利用Inverse-PCR技术获得Ammrjp1基因在家蝇基因组上插入位点侧翼序列。与野生型家蝇比较,G8代Ammrjp1转基因家蝇4龄幼虫的百头重增加8.6%。家蝇遗传转化体系的成功构建,为建立新型转基因生物反应器和开发高值动物蛋白饲料提供技术支持。

摘要: 对家蝇溶菌酶(Musca domestica lysozyme,MDLZM2)基因进行克隆、序列分析,构建原核表达载体并在大肠杆菌中表达。从Gen Bank家蝇基因组中筛选获得MDLZM2基因。以该基因的序列设计引物,进行PCR扩增,测序分析获得该基因完整编码序列。运用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白的基本理化性质、信号肽、二级结构、三级结构和保守结构域等方面进行预测和分析。构建p EASY-E1-MDLZM2重组质粒,转化到大肠杆菌BL21(DE3)p Lys S Chemically Competent Cell中进行诱导表达及纯化。结果表明MDLZM2基因ORF全长552 bp,编码183个氨基酸,理论分子量21.2 k Da;等电点为6.13,具有Lysozyme家族的蛋白保守结构域。成功构建重组原核表达p EASY-E1-MDLZM2并诱导表达、纯化重组蛋白,为进一步研究该蛋白的生物学及免疫学活性奠定了基础。

摘要: 克隆家蝇内源性β-葡萄糖苷酶(beta-glucosidase,BG)基因,建立两种原核表达体系和一种真核表达体系,分别检测表达产物的活性,比较不同表达体系对其表达水平及重组蛋白酶学性质的影响,为进一步研究和利用家蝇BG酶奠定基础。本研究根据BG酶基因的cDNA序列设计引物扩增BG酶基因成熟肽的基因片段,分别采用表达载体pET-28a(+)和pEGX-4T-1构建原核表达体系并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达。在65 kDa附近均出现特异性蛋白条带,进行Western Blotting鉴定证实重组质粒在其宿主菌E.coli BL21(DE3)中成功表达,命名为MDBG-1蛋白和MDBG-2蛋白。同时选用真核表达载体pPICZa A构建酵母分泌型表达体系在酵母细胞GS115中获得稳定的表达,将其命名为MDBG-3蛋白。采用七叶苷平板法和DNS法对三种表达体系所重组表达的蛋白进行酶活性鉴定和检测,显示3种表达体系所表达的融合蛋白均具有BG酶活性,其酶活力有所不同,且真核表达体系所表达的蛋白酶活性最高。本研究对家蝇β-葡萄糖苷酶基因表达的重组蛋白特性进行初步研究,为发现新的有效纤维素酶体系提供基础数据。

摘要: 为探明家蝇重组Serpin15蛋白的体外活性和酶稳定性,本文对家蝇Serpin15基因进行了生物信息学分析和克隆表达,并对纯化后的家蝇重组Serpin15蛋白进行了酶特性的研究。结果显示:家蝇Serpin15基因ORF框全长为1 353 bp,编码450个氨基酸,理论分子量为51 076.63 Da,有信号肽和一个标志抑制活性的功能结构域RCL反应环;成功构建原核表达载体pET-28a(+)-Serpin15,经诱导表达和纯化获得家蝇重组Serpin15蛋白;重组蛋白酶特性研究发现,家蝇重组Serpin15蛋白对胰蛋白酶有极显著的抑制作用,此外,将重组Serpin15蛋白经20～60℃热处理15 min,或经pH 6～10过夜处理,或经50℃和pH 8处理后室温存放15～90 min,重组蛋白的胰蛋白酶抑制活性均仍大于70%。研究结果为家蝇Serpin15蛋白的免疫功能研究奠定了重要实验基础,也为有害昆虫杀虫剂的研发提供思路。