摘要: 【目的】农药施加不当导致环境污染严重,已成为蚕桑业发展面临的紧迫问题。本研究旨在评估大田喷洒有机磷农药乐果污染间作桑园可能导致对家蚕Bombyx mori正常发育的影响,以分析乐果对家蚕生殖腺的毒理损伤影响。【方法】以文献报道的乐果对家蚕幼虫的LD_(50)为400 mg/L作为参考依据,给家蚕5龄幼虫添食不同浓度(0, 50, 100, 200和400 mg/L)乐果溶液浸叶处理的桑叶,测定乐果处理后5龄幼虫茧质和体重,雌、雄幼虫生殖腺中乐果残留含量和H_2O_2含量,抗氧化酶(SOD和CAT)活性及其mRNA表达。【结果】结果显示,乐果处理后家蚕5龄幼虫茧质和体重以及雌、雄幼虫生殖腺中乐果残留含量均具有浓度-效应关系。100200 mg/L乐果浓度添食下,雌雄幼虫生殖腺中H_2O_2含量与对照(清水)相比均显著上升。随着添食浓度的增加,SOD和CAT活性都出现先降低后升高的趋势,但均低于对照组。sod和cat的mRNA表达水平与相应的酶活性具有正相关性。通过HE染色以及生精囊的体外培养,观察到在乐果处理后雌、雄幼虫生殖腺的形态结构发生变化,表现为形态畸形,细胞内空泡增大,生殖细胞数目相对减少,且随浓度的增加,生殖腺损伤越严重。【结论】本研究结果说明,采用乐果对家蚕的LD_(50)以下浓度溶液浸叶添食于5龄幼虫,对家蚕生殖腺发育有毒理损伤的影响,这为从蚕业生产角度全面禁止大田使用乐果和加强农业生产区划管理提供了依据。

摘要: 【目的】前期研究中发现的一个家蚕Bombyx mori C/D box snoRNA Bm-15能够与类Notch受体基因(Notch-like receptor gene,NLR)发生体外互作。本研究旨在了解家蚕中snoRNA Bm-15与NLR的互作机制。【方法】利用实时荧光定量PCR检测snoRNA Bm-15和NLR在家蚕幼虫、蛹及成虫不同发育阶段的表达谱;利用原位杂交鉴定snoRNA Bm-15与NLR在BmN4细胞中的定位,以探索两者之间的互作机制。【结果】表达谱分析发现,snoRNA Bm-15及NLR在家蚕幼虫期的表达趋势基本一致,均呈现先下降后上升的趋势,2龄幼虫中表达量最低。在家蚕化蛹过程中,snoRNA Bm-15表达量呈现逐渐下降的趋势,到处女蛾时表达量最低。而NLR在雌虫化蛹后第1天表达量最低,处女蛾中表达量最高。利用原位杂交进行细胞定位发现,snoRNA Bm-15不仅存在于BmN4细胞核中,在细胞质中也有分布;而NLR则大部分分布于细胞核中,与Bm-15在核内有位置重叠。【结论】首次在鳞翅目昆虫中发现一个snoRNA Bm-15同时存在于细胞核和细胞质中,与其互作的基因NLR则主要存在于细胞核中,与Bm-15有位置重叠。二者在家蚕幼虫阶段存在一致的表达模式,在化蛹及化蛾过程中存在相反的表达模式,提示snoRNA Bm-15与NLR在家蚕不同发育阶段可能存在不同的互作模式。

摘要: 【目的】本研究旨在阐明家蚕微孢子虫Nosema bombycis感染不同时间对家蚕Bombyx mori幼虫不同组织中家蚕海龟蛋白(Bombyx Turtle, Bmtutl)基因表达水平的影响,为揭示家蚕微孢子虫的侵染机制奠定基础。【方法】利用生物信息学方法对家蚕海龟蛋白3种亚型Bmtutl-464, Bmtutl-519和Bmtutl-810的序列结构特征进行了分析;利用qPCR检测家蚕微孢子虫感染后12, 24, 48, 72, 96和120 h,家蚕幼虫中肠、血淋巴与脂肪体组织中Bmtutl-464,Bmtutl-519和Bmtutl-810基因表达水平的变化情况。【结果】家蚕海龟蛋白3种亚型的二级结构均主要由无规则卷曲、α螺旋、β转角和延伸链组成,其中无规则卷曲所占比例最高。但是PredictProtein分析发现,Bmtutl-464, Bmtutl-519和Bmtutl-810之间的蛋白/多核苷酸结合位点存在较大差异。qPCR结果表明,感染家蚕微孢子虫后,家蚕幼虫中肠、血淋巴与脂肪体组织中Bmtutl-464,Bmtutl-519和Bmtutl-810基因的整体表达处于被抑制状态,尤其在脂肪体中最为明显:Bmtutl-519和Bmtutl-810基因的表达在家蚕微孢子虫感染家蚕后的72 h开始受到显著抑制,特别是Bmtutl-519基因,其相对表达水平均不到对照的5.0%。【结论】家蚕海龟蛋白这3种亚型的序列结构特征存在较大差异,家蚕微孢子虫感染在一定程度抑制了家蚕幼虫中肠、血淋巴与脂肪体组织中Bmtutl-464,Bmtutl-519和Bmtutl-810基因尤其是Bmtutl-519的表达。结果说明,与其他两种家蚕海龟蛋白亚型相比,Bmtutl-519蛋白可能在家蚕微孢子虫侵染宿主的过程中起主要作用。

摘要: 【目的】通过体腔显微注射非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)过表达载体,研究注射后ncRNA在家蚕Bombyx mori幼虫不同组织中的表达情况,探索研究家蚕ncRNA功能的便捷方法。【方法】利用显微注射仪(玻璃显微注射针)在家蚕5龄第3天幼虫第7-8腹节褶皱处分别注射家蚕ncRNA Bm-15和Bm-152过表达载体piggyBac[A3-EGFP-A3-Bm-15]和piggyBac[A3-EGFP-A3-Bm-152],注射48 h后提取家蚕幼虫头、胸、尾部、腹部背板、腹部腹板和丝腺总RNA,荧光定量PCR检测Bm-15和Bm-152在家蚕幼虫不同组织中的表达情况。【结果】采用玻璃显微注射针造成的创伤面小,注射后家蚕出现感染和死亡的比例低于10%。注射ncRNA Bm-15过表达载体后,在家蚕幼虫头部和尾部都检测到Bm-15的显著性过表达,头部中Bm-15表达量较注射piggyBac[A3-EGFP]空载体时上升了17倍,在其他4个组织中Bm-15表达量与正常饲养组家蚕对照相比变化不显著。注射Bm-152过表达载体后,同样在家蚕幼虫头部和尾部都检测到Bm-152的显著过表达,其中头部中的表达量较注射piggyBac[A3-EGFP]空载体时上升了6. 6倍。腹部背板和丝腺中Bm-152过表达效果也较明显,分别是注射piggyBac[A3-EGFP]空载体时表达量的3. 4和4. 5倍。【结论】体腔显微注射ncRNA过表达载体可以实现ncRNA在家蚕头部中稳定过表达。本研究为后续研究神经相关ncRNA的功能提供了较好的思路和方法。

摘要: 【目的】昆虫脂肪体是物质合成代谢、先天免疫的重要器官。ATG8蛋白的亚细胞定位是细胞自噬的主要指标之一,细胞核皱缩是细胞凋亡的形态标记之一,目前家蚕Bombyx mori中尚未在蜕皮和变态发育进程中对BmATG8蛋白的细胞生物学变化进行观察。本研究旨在同时检测家蚕脂肪体细胞中BmATG8蛋白亚细胞定位和细胞核皱缩的时空变化,研究蜕皮激素(20E)信号对两者的调控作用。【方法】利用免疫荧光和Hoechst染色方法,分别在家蚕幼虫4龄第2天至预蛹第2天、5龄第2天幼虫注射20E (10μg/头)后以及对游走期幼虫脂肪体中20E受体基因usp进行RNAi后,检测家蚕脂肪体中BmATG8蛋白定位和细胞核形态变化。【结果】在家蚕幼虫蜕皮和幼虫-蛹变态发育时期,BmATG8蛋白高水平存在于脂肪体细胞中,同时细胞核发生皱缩。在正常摄食时期,20E处理(10μg/头)能够诱导细胞中大量出现BmATG8蛋白且存在于细胞质中并诱导细胞核皱缩。对usp基因进行RNAi后,脂肪体细胞内的BmATG8蛋白显著减少,同时细胞核皱缩减弱。【结论】家蚕BmATG8蛋白不仅在幼虫-蛹变态时期细胞质中大量存在,而且在幼虫蜕皮时期也大量表达,与细胞核的皱缩同时出现,BmATG8蛋白在细胞质中的定位与细胞核皱缩两者均受到20E信号通路的调控。本研究为BmATG8蛋白功能及其调控机制的深入研究提供了重要的科学依据。