摘要: 【目的】配子生成素结合蛋白2(gametogenetin binding protein 2, ggnbp2)在哺乳动物配子发生等生殖相关过程中发挥重要作用。本研究以家蚕Bombyx mori为模型,探究驯化基因ggnbp2的生物学功能,为鳞翅目昆虫中该基因的深入研究提供线索。【方法】在NCBI GenBank数据库通过序列比对检索到翅目昆虫ggnbp2基因的序列;通过贝叶斯法构建系统发育树进行ggnbp2基因的系统发育分析。根据我们前期研究建立的家蚕-野桑蚕Bombyx mandarina群体基因组多态性数据,对家蚕中Bmggnbp2进行选择信号分析;利用已发表的基因芯片数据分析Bmggnbp2在家蚕5龄第3天幼虫中的组织表达特征。利用CRISPR/Cas9双元转基因体系构建Bmggnbp2敲除突变体,测定分析突变体与对照品系Nos-Cas9在繁殖性状(单雌产卵量和卵孵化率)以及与对照品系U6-Bmggnbp2sgRNA和Nos-Cas9经济性状(全茧重、蛹重和茧壳重)的差异。【结果】ggnbp2在鳞翅目昆虫中广泛存在,且高度保守,并且在家蚕中具有强烈的人工选择信号。Bmggnbp2在家蚕5龄第3天幼虫的脑、卵巢、精巢和丝腺中均高度表达。利用CRISPR/Cas9双元转基因体系成功获取家蚕Bmggnbp2基因的嵌合体敲除突变体△Bmggnbp2。与对照Nos-Cas9精巢的典型肾形不同,突变体△Bmggnbp2的精巢呈椭圆形,并且表面出现一层较厚的黄色覆盖物,但突变体△Bmggnbp2单雌产卵量和卵孵化率与对照品系Nos-Cas9以及全茧重、蛹重和茧壳重与对照U6-Bmggnbp2sgRNA和Nos-Cas9均没有显著差异。【结论】GGNBP2在鳞翅目昆虫中对繁殖的影响可能并没有在哺乳动物中那么至关重要,其具体的作用机制仍需要进一步探讨。

摘要: 【目的】探究组蛋白H3Ser10磷酸化(H3Ser10ph)在家蚕Bombyx mori精母细胞减数分裂中的功能。【方法】解剖并分离家蚕4龄幼虫至蛹期精巢组织,通过丙烯酰胺凝胶包埋制备处于减数分裂不同时期的精巢组织玻片,以免疫荧光标记检测H3Ser10ph抗体在精母细胞减数分裂不同时期的定位特点。【结果】在家蚕有核精子精母细胞减数分裂过程中,组蛋白H3Ser10的磷酸化发生在粗线期染色体的特定位置,双线期H3Ser10ph信号逐渐减弱,至终变期时在染色体上完全检测不到磷酸化信号。随着细胞周期的进行,磷酸化信号又开始逐渐增强,减数第一次分裂中期时达到最高水平。当细胞进入减数第二次分裂前中期时,染色体臂上的H3Ser10ph信号消失,在靠近纺锤体微管的分裂面处有弥散的H3Ser10ph抗体的信号,减数第二次分裂末期,仅剩余非常微弱的H3Ser10ph信号残留于染色体的特定位置。在无核精子精母细胞减数分裂过程中,在中期Ⅰ至末期Ⅰ一直在染色体上有较均一的H3Ser10ph信号,后期Ⅰ时纺锤丝微管与赤道面平行。【结论】组蛋白H3Ser10磷酸化与家蚕有核精子和无核精子精母细胞减数分裂中染色质的动态变化相关。

摘要: 【目的】制备家蚕Bombyx mori抗真菌因子BmSPI39的多克隆抗体,分析BmSPI39对球孢白僵菌Beauveria bassiana入侵的表达响应。【方法】利用原核表达和固定化镍离子亲和层析技术获得高纯度的BmSPI39重组蛋白,利用胶内活性染色检测重组蛋白BmSPI39对枯草杆菌Bacillus subtilis蛋白酶A的抑制活性;利用重组蛋白BmSPI39,通过免疫新西兰大白兔制备BmSPI39的多克隆抗体。基于家蚕开放性数据库SilkDB 3.0,分析BmSPI39在4龄第3天至化蛹后1 d家蚕免疫相关组织体壁、中肠和脂肪体中的时空表达特征。利用制备的BmSPI39抗体通过Western blot分析感染球孢白僵菌不同时间后家蚕幼虫和蛹体壁中BmSPI39应答球孢白僵菌入侵的表达响应。【结果】胶内活性染色结果显示,重组BmSPI39蛋白能够强烈抑制枯草杆菌蛋白酶A的活性。酶联免疫吸附结果显示,BmSPI39抗血清的抗体效价达1∶128 000。Western blot和胶内活性染色结果显示,纯化后的BmSPI39抗体能够有效结合不同多聚体化状态下的BmSPI39抗原蛋白。BmSPI39表达数据的热图分析显示,BmSPI39在游走期和预蛹期的家蚕体壁中有表达,在预蛹期的脂肪体中的表达量较高,但在各发育阶段的中肠中均不表达。Western blot分析结果表明,家蚕幼虫体壁中的BmSPI39的表达在感染球孢白僵菌后84 h上调表达,108和120 h下调表达。【结论】本研究成功制备了BmSPI39的多克隆抗体。BmSPI39蛋白的表达能够响应球孢白僵菌入侵,可能参与蛹期家蚕抵御真菌入侵的过程。

摘要: 【目的】肽聚糖识别蛋白(peptidoglycan-recognition proteins, PGRP)可以特异性识别细菌细胞壁中的肽聚糖(peptidoglycan, PGN),并通过免疫缺陷(immune deficiency, IMD)途径和Toll途径诱导昆虫抗菌肽的产生。本研究旨在探讨家蚕Bombyx mori肽聚糖识别蛋白BmPGRP-S5的抑菌活性及在引发家蚕细胞免疫中的作用。【方法】用果蝇胚胎S2细胞表达BmPGRP-S5蛋白;通过细菌生长曲线法检测BmPGRP-S5蛋白对大肠杆菌Escherichia coli K_(12)D_(31)、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus和巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium的抑菌活性;ELISA检测BmPGRP-S5蛋白与大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis胞壁组分的结合力;通过测定吸光值和观察家蚕血淋巴黑化反应分析BmPGRP-S5对细菌胞壁组分激活酚氧化酶原(prophenoloxidase, PPO)的影响,并通过异硫氰酸荧光素(FITC)标记法检测BmPGRP-S5对家蚕血细胞吞噬细菌的影响。【结果】获得表达纯化的BmPGRP-S5蛋白。BmPGRP-S5蛋白对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌K_(12)D_(31)和巨大芽孢杆菌无抑菌效果,加入40μmol/L的Zn(2+)后,其对巨大芽孢杆菌的抑菌效果明显增强。ELISA结果表明,BmPGRP-S5蛋白与来自金黄色葡萄球菌的PGN和枯草芽孢杆菌脂磷壁酸(LTA)的结合能力较强,同时也促进了这两种细菌胞壁组分激活家蚕血淋巴酚氧化酶原,加快胞璧组分介导的家蚕血淋巴黑化反应。加入BmPGRP-S5蛋白后,家蚕血细胞对金黄色葡萄球菌的吞噬率提高到53.33%左右,对大肠杆菌K_(12)D_(31)的吞噬率在25.83%左右,对巨大芽孢杆菌的吞噬率达30.83%左右,与对照组相比显著增强。【结论】BmPGRP-S5抑菌作用依赖于Zn(2+),可能与其酰胺酶活性有关。BmPGRP-S5可以通过识别细菌胞壁组分PGN或LTA在家蚕的黑化反应和细胞吞噬中发挥作用。本研究使用的BmPGRP-S5蛋白是通过在果蝇S2细胞进行重组表达获得,更能真实地反映其在昆虫体内生理状态下的功能活性。因此,本研究的结果对进一步开发利用BmPGRP-S5有指导意义。

摘要: 【目的】家蚕Bombyx mori非滞育红卵突变体Re-nd是家蚕品种C108经化学诱变剂N-甲基-N-亚硝基脲(N-methyl-N-nitrosourea, MNU)诱导产生的新型卵色突变体,属于浆液膜突变。本研究旨在通过传统的遗传学方法分析其突变表型产生的机理,为进一步对Re-nd突变基因的克隆和功能研究及应用奠定基础。【方法】非滞育家蚕突变体Re-nd与野生型滞育的二化品种大造(Dazao)和非滞育的多化品种N4杂交、同胞交配及回交,然后进行遗传分析;同时,Re-nd与已知滞育白卵突变体w-2、桃红眼白卵突变体pe及红卵突变体re杂交、同胞交配及回交,然后进行遗传分析。【结果】结果显示,Re-nd分别与大造和N4杂交F_1代的非滞育卵都为淡红色;同胞交配的F_2代非滞育卵色为红色、淡红色和淡黄色,其红卵(包括淡红色卵)与淡黄色卵的数量比基本符合3∶1;回交B_1代非滞育卵为红色和淡黄色,其数量比基本符合1∶1。Re-nd与w-2和pe杂交的F_1代均表现为淡褐色滞育卵色;与w-2杂交产生的F_2代滞育卵色表型有正常深褐色、淡褐色、黄色以及淡黄偏微红色,非滞育卵表型有红色、淡黄偏微红色、橙黄色以及淡黄色;与pe杂交产生的F_2代卵都是滞育卵,其卵色表型有正常深褐色、淡褐色、淡黄偏微红色以及红色;与re杂交F_1代均表现为淡褐色滞育卵色,F_2代都为滞育卵,其卵色表型有正常深褐色、淡褐色以及红色,re亲本滞育卵的颜色为红色,F_2代卵中并没有分离出新的卵色。【结论】通过杂交和遗传分析,证实了Re-nd突变体为独立的显性遗传,Re-nd突变基因位于w-2及pe突变基因的下游,可能参与了不同于野生型卵色素代谢分支,即卵中眼色素生物合成后期3-羟基-犬尿氨酸进一步代谢合成奥敏类(ommatins)色素的过程。