摘要: 昆虫羧酸酯酶是一类能对外源化合物解毒和气味分子降解的重要酶系。本研究选取在家蚕Bombyx mori幼虫嗅觉感器中有表达,并与蛀茎夜蛾Sesamia nonagrioides触角酯酶基因Snon-EST可能为直系同源基因的Bmae35进行克隆和外源表达研究。结果表明:该基因编码区长1581bp,共编码526个氨基酸。与其他昆虫触角酯酶的多序列比对分析发现,Bmae35编码的蛋白具有酯酶活性必须的催化残基Ser191,Glu313和His429,也保持着α-酯酶家族特征基序Gly-x-Ser-x-Gly。RT-PCR分析显示,Bmae35在家蚕5龄第3天各组织中均有表达,其中在头、脂肪体、马氏管、体壁和丝腺中的表达量较高。Bmae35在雌蛾性信息腺中表达,并与性信息素合成呈正相关,暗示其在信息素合成中起重要作用。构建Bmae35与pET28(a)重组载体,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导,电泳检测发现该基因以包涵体形式表达,以镍亲和层析柱纯化,Western blotting鉴定证实Bmae35在大肠杆菌Escherichiacoli中正确表达并得以纯化。本实验通过对家蚕Bmae35基因的克隆、原核表达与纯化,为进一步深入研究其表达定位和气味降解等功能奠定基础。

摘要: 丝氨酸蛋白酶抑制剂4(serpin-4)为丝氨酸蛋白酶抑制剂家族中的一员。本研究旨在研制高效价的家蚕Bombyxmoriserpin-4多克隆抗体,为深入研究serpin-4基因的生理功能打下物质基础。首先于家蚕脂肪体中克隆了serpin-4基因,利用基因重组技术构建了pET28a-serpin-4原核表达载体,经IPTG诱导,获得原核表达重组融合蛋白,利用镍柱回收纯化技术,获得目的蛋白;经SDS-PAGE和抗His多抗检测,纯化蛋白的分子量大小与预测的一致,即获得了高纯度的目的蛋白,以此蛋白为免疫抗原,采用4次免疫方式对昆明小鼠进行抗原免疫,最终获得抗serpin-4的多克隆抗体血清;该血清经ELISA和Westernblot验证,效价达到1:20000,特异性较好。家蚕serpin-4多克隆抗体的成功制备,一方面表明应用于其他生物的多克隆抗体制备所采用的方法对于家蚕serpin基因的研究同样适用;另一方面,也为深入研究家蚕serpin-4的生理功能打下了物质基础。

摘要: 羧酸酯酶是一个多功能超家族酶类,为研究羧酸酯酶基因在家蚕Bombyxmori组织中的功能,利用5′/3′RACE和RT-PCR方法克隆了一个家蚕羧酸酯酶基因BmCarE-9,其GenBank登录号为EU523534。该基因含有一个1 680 bp的ORF,编码559个氨基酸。BmCarE-9预测的分子量64.2 kD,等电点7.13,结构分析表明BmCarE-9存在一个类似的催化三联体,其中两个残基发生改变。利用实时荧光定量PCR方法研究了该基因在家蚕5龄第3天幼虫不同组织以及在5龄期各日龄幼虫丝腺组织中的表达水平。结果表明,该基因在丝腺中特异性高表达,且主要在中部和后部丝腺中表达。该基因在5龄期随着丝腺的生长发育表达量逐渐增高,到末期表达水平逐渐降低。据此推测该基因可能与丝腺的生长发育或丝蛋白的合成相关。

摘要: 为探讨家蚕Bombyxmori蛾触角发生发育、结构与功能的分子基础和调控机制,我们采用双向电泳结合基质辅助质量飞行时间质谱(MALDI-TOF/MS)技术初步探讨了家蚕蛾触角蛋白及其雌雄表达差异。采用ImageMast 6.0软件分析电泳图谱,在家蚕蛾触角中检测到约550个蛋白点,主要集中在分子量1470 kD,等电点48之间。从雌雄蛾触角电泳图谱中分别检测到419和489个蛋白点,其中雌雄匹配蛋白点有326对,匹配率为71.81%。雌雄间表达差异点有34个,雌雄分别所特有的特异蛋白点分别为9和20个。对特异和差异点进行MALDI-TOF/MS鉴定获得其中5种蛋白——成虫原基生长因子(imaginal disk growth factor)、表皮蛋白RR-1基序15(cuticular protein RR-1 motif15)、硫醇过氧化还原酶(thiol peroxiredoxin)、空泡ATP酶B亚基(vacuolar ATPase B subunit)以及gasp前体(gaspprecursor),它们在雄蛾触角中表达量都比雌蛾高。这为家蚕触角蛋白的进一步研究提供了基本信息。

摘要: 为探索细菌表达目标基因dsRNA介导的RNAi技术是否在家蚕Bombyx mori可行,本研究引入了在其他物种中广泛应用的细菌表达dsRNA的RNAi系统:HT115细菌株和L4440质粒。利用L4440载体两端含有T7启动子的特点,设计并构建了针对家蚕核受体FTZ-F1基因的RNA干扰(RNA interference)载体,将构建好的质粒转入大肠杆菌Escherichia coliHT115,在IPTG诱导下成功获得目标基因对应双链RNA(dsRNA)。结果显示:通过对5龄第7天家蚕幼虫注射IPTG诱导后提取的FTZ-F1基因对应的dsRNA25μg,85%的蛹变态发育过程明显延迟,不能实现幼虫到蛹的形态完全转变。荧光定量PCR分析显示目标基因的表达得到了特异的抑制。实验结果初步表明,通过细菌表达目标基因dsRNA介导的RNAi策略,以其经济、高效的特点,具有广泛应用于家蚕基因功能研究中的潜力。