摘要: 【目的】家蚕Bombyx mori核型多角体病毒(Bm NPV)核衣壳蛋白VP39为病毒装配所必需。本研究旨在初探VP39在病毒侵染家蚕细胞过程中的功能及特征,以期为家蚕抗病毒研究提供研究基础。【方法】本研究通过构建原核表达载体,诱导原核表达得到多克隆抗体,以Western blot验证VP39表达时相;构建真核表达载体,转染细胞后以免疫荧光手段观测VP39表达定位及影响病毒增殖现象。【结果】制备了VP39多克隆抗体。VP39在病毒感染后大量定位于家蚕细胞核,部分定位于胞质,而过表达的VP39定位于家蚕细胞胞质;过表达VP39后抑制Bm NPV感染家蚕细胞。【结论】在Bm N-SWU1细胞中过表达VP39会影响Bm NPV的扩散,导致Bm NPV感染细胞数目大量减少。该结果为VP39调控宿主与病毒的相互作用提供了新的思路。

摘要: 【目的】探讨DNA甲基化及组蛋白乙酰化是否参与家蚕Bombyx mori免疫反应的调控。【方法】对家蚕与其他生物的DNA甲基转移酶(DNMT)、组蛋白去乙酰化酶(HDAC)与组蛋白乙酰转移酶(HAT)的蛋白序列进行系统进化分析;利用定量PCR检测家蚕5龄第3天幼虫感染病原菌绿脓杆菌Pseudomonas aeruginosa和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus后Bm DNMT1,Bm HDACI-1,Bm HDACI-2和Bm HAT1在家蚕脂肪体组织中的表达变化;给家蚕5龄第2天幼虫注射DNMT,HDAC和HAT抑制剂,观察它们对家蚕感染细菌后的存活率的影响。【结果】系统进化分析显示,Bm DNMT1在进化上呈现特殊性,独立于其他昆虫DNMT1的进化,而Bm HDACs和Bm HAT在进化上相对保守。定量PCR检测表明,在两种细菌感染后,Bm DNMT1,Bm HDACs和Bm HAT1在家蚕幼虫脂肪体中的表达水平均有不同程度的上升。然而,DNMT,HDAC和HAT抑制剂对家蚕幼虫感染细菌后的存活率并无明显影响。【结论】本研究发现感染绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌后,家蚕幼虫脂肪体中Bm DNMT1,Bm HDACs和Bm HAT1的表达水平有不同程度的上调,推测DNA甲基化和组蛋白乙酰化/去乙酰化可能参与家蚕免疫反应的调控。

摘要: 【目的】本研究旨在克隆获得家蚕Bombyx mori Caspase家族基因,并通过RNAi技术初步分析其在家蚕细胞水平细胞凋亡中的功能。【方法】用c DNA末端快速扩增方法(rapid amplification of c DNA ends,RACE)克隆家蚕Caspase家族一个新基因,用RNAi和流式细胞术初步分析该基因在家蚕细胞凋亡中的功能。【结果】将克隆获得的家蚕Caspase家族基因命名为Bm Caspase-X,其全长为2 105 bp,开放阅读框长为1 494 bp,编码497 aa,分子量为57.8 k Da,等电点为5.29。Bm Caspase-X含有Caspase特有的结构位点。系统进化分析表明,Bm Caspase-X与家蚕ICE同其他昆虫Caspase-4同源物先聚在一起,再与具有长前体结构域的昆虫其他因子聚为一类。RNAi初步结果显示该基因干扰后没有出现明显的细胞凋亡。【结论】Bm Caspase-X具有典型Caspase特征,属于Caspase家族成员。目前RNAi实验结果表明Bm Caspase-X未能引起家蚕细胞凋亡的改变。本文为进一步研究该基因的功能奠定基础。

摘要: 【目的】非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)在家蚕Bombyx mori发育过程中具有重要调控作用。本研究旨在探索ncRNA参与家蚕神经系统发育的分子机理。【方法】采用实时荧光定量PCR技术对22个中等长度的ncRNA及3个ncRNA的邻近编码基因在家蚕幼虫神经系统中的表达水平进行检测。【结果】8个ncRNA(包括1个C/D box snoRNA,4个H/ACA box snoRNA和3个不能归类的ncRNA)在家蚕5龄幼虫神经组织和非神经组织中均有表达,且在胸腹神经中的表达量明显高于头部神经中的表达量。其中,snoRNA Bm-51,Bm-18和Bm-86在胸腹神经中的表达量分别是头部神经中的23,5和4.7倍。进一步研究发现,这3个内含子起源的ncRNA与其宿主基因在家蚕神经系统中的表达趋势一致,宿主基因在胸腹神经中的表达量也明显高于头部神经中的表达量。【结论】本研究筛选到的在家蚕不同神经部位存在差异表达的ncRNA,特别是在胸腹神经中高表达的ncRNA可能协同其邻近编码基因,参与家蚕神经发育或神经活动过程。该结果为研究ncRNA参与家蚕神经系统发育提供了分子依据,为从非编码RNA角度探索鳞翅目害虫防治提供了新的思路。

摘要: 【目的】家蚕Bombyx mori微粒子病一直影响着蚕种业的健康发展,快速而准确地检测出寄生于蚕卵中的家蚕微孢子虫Nosema bombycis对于有效控制家蚕微粒子病危害意义重大。【方法】环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)法是一种快速、灵敏、特异的DNA体外恒温扩增方法,本文基于LAMP检测法的原理,依据家蚕微孢子虫孢子繁殖复制相关的EB1基因(Gen Bank登录号:KF421134.1)设计LAMP引物,对LAMP反应体系的最佳反应温度、内外引物浓度比、检测反应的特异性、灵敏度等进行研究,建立了一种检测蚕卵感染家蚕微粒子病的LAMP检测方法。【结果】结果表明,基于EB1基因建立的LAMP检测方法在63℃恒温下在1.5 h内就可完成对样品的有效检测,本LAMP法对家蚕微孢子虫孢子DNA的检测灵敏度为5.0×10-3ng/μL,对EB1-p MDTM19-T质粒标准品的检测灵敏度为1.0×102copies/μL,同时对人工感染家蚕微粒子病单个母蛾产下蚕卵的1/8卵圈量或1粒蚕卵均能检出阳性结果。上述结果都分别应用凝胶电泳法、恒温荧光检测仪以及SYBR GreenⅠ显色肉眼观察法得到同步判定。【结论】本研究建立的基于EB1基因LAMP法可用于蚕卵微粒子病的检测,LAMP法为蚕种质量检验及成品卵微粒子病现场检疫提供了新技术。