摘要: 【目的】通过对家蚕尿苷磷酸化酶1基因(BmUPase1)的克隆、原核表达、生物信息学分析及各组织和各时期的表达变化的研究,为揭示其在家蚕Bombyx mori中发挥的作用奠定基础。【方法】以家蚕整蚕的cDNA为模板克隆获得BmUPase1基因的编码框序列。利用生物信息学软件分析序列特性。对该基因编码的蛋白质进行原核表达,为后续制备抗体提供条件。通过qPCR对BmUPase1在家蚕各组织中和各时期的表达量进行分析。【结果】BmUPase1基因的完整ORF框序列全长1 188 bp,编码395个氨基酸,分子式为C_(1945)H_(3074)N_(538)0_(591)S_(21),分子量大小为44.12 ku,具有尿苷磷酸化酶(UPase)超家族的保守结构域PNP_UDP_1。进化分析可知:家蚕与斜纹夜蛾Spodoptera litura、棉铃虫Helicoverpa armigera、小菜蛾Plutella xylostella、夏威夷红蛱蝶Vanessa tameamea等亲缘关系最近。qPCR结果显示BmUPase1基因在家蚕各个组织中都有表达,说明BmUPase1对于家蚕的生长发育具有重要的作用。时期表达谱结果显示,BmUPase1在家蚕化蛹、蛹期和蛾期的表达量升高,推测其与家蚕化蛹及化蛾有关。pET28a-BmUPase1重组载体在大肠杆菌BL21中成功表达,与预测大小一致。【结论】本研究首次克隆了BmUPase1基因,其在家蚕的各个组织和各个时期都有表达,可能对家蚕的生长发育具有重要的作用。对其表达模式进行分析,为进一步研究蛋白质的功能奠定基础。

摘要: 【目的】研究分析编码蛋白酶体调控复合物亚基基因BmRpt4(Regulatoryparticletriple-A ATPase4,BGIBMGA010794)在家蚕翅膀发育过程中的功能。【方法】利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术,将BmRpt4的gRNAs和Cas9mRNA直接注射到家蚕胚胎中,观察G0代家蚕个体雏翅率,并分析雏翅个体中BmRpt4基因突变情况。【结果】经统计,对照组G0代家蚕个体均表现为正常翅,而实验组注射BmRpt4的gRNAs和Cas9 mRNA后,G0代约66.7%家蚕个体表现出小翅表型。在分子水平上对小翅表型个体进行检测,发现BmRpt4基因在两个gRNA及其之间位置均有不同长度片段的缺失或者插入,说明在这些突变个体中BmRpt4基因被不同程度的敲除,从而其功能缺失,导致出现小翅表型。【结论】该研究结果表明编码蛋白酶体调控亚基的BmRpt4基因在家蚕翅膀发育中具有重要作用,为蛋白酶体在生物组织器官发育中调控作用研究提供重要实验依据。

摘要: 【目的】本研究以漂白粉液浸渍消毒(以下简称浸消)桑叶饲喂家蚕为处理组,分析了不同组之间家蚕中肠细菌数量的差异;探讨了各组家蚕中肠产消化酶(蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶)细菌的菌株数量、产酶种类及相对产酶能力的差异。【方法】用16S rDNA测序技术对产酶菌株进行了鉴定,比较各组产酶菌种类的不同。【结果】饲喂不同有效氯浓度漂白粉液浸消叶对家蚕中肠细菌的数量、产酶菌数量均有抑制作用,且随有效氯浓度升高抑制作用增强;各处理组产蛋白酶菌株平均相对产酶能力均低于清水组,且清水组肠液中产淀粉酶菌株数明显多于各处理组;取食漂白粉液浸消桑叶后,家蚕中肠产消化酶细菌类群构成有一定变化,清水组和全程0.3%组产酶菌属相对较丰富,有Staphylococcus sp.、Lelliottiasp.和Buttiauxella sp.,其他处理组的产酶菌属相对单一,只有Staphylococcus sp.。【结论】以上结果说明漂白粉对家蚕中肠内细菌及产酶菌的增殖有抑制作用,中肠内产蛋白酶菌的产酶能力和产淀粉酶菌株的数量也受到抑制,对产酶菌类群构成有一定影响。

摘要: 【目的】本试验旨在研究不同生长发育时期家蚕幼虫咽侧体及其腺细胞的变化。【方法】选取家蚕4眠蚕中限品种作为实验材料,对其4龄、5龄等时期进行解剖处理,得到咽侧体后进行透析处理与DAPI染色,在荧光显微镜下成荧光像图,结合软件分析工具测量咽侧体横截面积直径与细胞数量来确定家蚕咽侧体及其腺细胞在不同生长时期的变化。【结果】咽侧体体积随幼虫生长发生了明显增长;咽侧体细胞数目随幼虫生长会增加,但比较缓慢。随着幼虫的生长,腺细胞体积会增大,同时咽侧体体积增长与腺细胞核体积增长有极显著相关性。【结论】家蚕咽侧体体积增长主要源于腺细胞体积的增大而稍带腺细胞数目的增加,家蚕幼虫咽侧体体积与生长发育的时间经过密切相关。

摘要: 【目的】CRISPR/Cas9是近些年报道较多的基因编辑新工具,具有简便高效、特异性强等优势。BmSuc1是从鳞翅目经济昆虫家蚕Bombyx mori体内发现的编码β-呋喃果糖苷酶(β-fructofuranosidase,β-FFase)的基因,也是首个被克隆和鉴定的动物型β-FFase编码基因。β-FFase是作用于果糖基的蔗糖水解酶,BmSUC1可能与家蚕防御桑叶生物碱的生理过程有关,但目前其发挥作用的分子机制尚不清晰。为了解析BmSuc1在蚕体的作用途径及其生理功能,本研究基于CRISPR/Cas9基因编辑系统构建表达双元sgRNA的CRISPR载体,用于敲除家蚕基因组中的BmSuc1基因。【方法】根据目的基因BmSuc1的ORF序列设计2条sgRNA,通过同源重组的方法分别插入CRISPR载体的Sal I和Nhe I酶切位点。进而利用转基因显微注射技术将该编辑载体注入G_0代蚕卵,经催青孵化饲养家蚕并自交制备G_1代蚕种。【结果】PCR验证及测序结果均表明CRISPR编辑载体构建成功。根据Ds Red2红色蛋白的荧光标记,从G_1代家蚕幼虫中成功筛选出阳性转基因个体。【结论】本文详细介绍了表达双元sgRNA的CRISPR载体的构建方法,所获得的阳性转基因家蚕对于下一步探讨BmSuc1在家蚕糖类营养的吸收与利用途径中的作用奠定了重要的实验基础,有助于阐明蚕-桑相互选择和适应的分子机制。