摘要: 【目的】黑腹果蝇Drosophila melanogaster雌激素相关受体(estrogen-related receptor,ERR)通过调节糖酵解过程进而控制果蝇的能量代谢。本研究在克隆家蚕Bombyx mori ERR基因(Bm ERR)的基础上,对其分子特性和系统演化进行生物信息学分析,并检测该基因在家蚕生殖腺中的表达,为进一步研究ERR功能奠定基础。【方法】采用PCR技术克隆Bm ERR基因的全长c DNA序列,进行生物信息学分析;利用半定量RT-PCR检测该基因在停食后家蚕幼虫生殖腺中的表达情况。【结果】Bm ERR基因全长c DNA序列为1 296 bp,编码431个氨基酸残基;具有ERR蛋白家族典型的结构特征;系统进化分析显示Bm ERR与其他昆虫ERR氨基酸序列一致性较高;半定量RT-PCR检测表明,Bm ERR在家蚕上簇到化蛾期间的精巢和卵巢中均有表达,表达具有时期特异性,化蛹第1天达到表达高峰。【结论】本研究首次从鳞翅目昆虫中克隆获得ERR c DNA序列。ERR基因在家蚕生殖腺中表达量无明显性别差异,但具有发育时期特异性。

摘要: 【目的】研究家蚕Bombyx mori经蜕皮激素(20-hydroxyecdysone,20-E)和保幼激素类似物(juvenile hormone analogue,JHA)处理后引起吡哆醛激酶(pyridoxal kinase,PLK)和磷酸吡哆醇氧化酶(pyridoxine-5'-phosphate oxidase,PNPO)的转录水平变化,为进一步研究激素对蚕体营养代谢等工作奠定基础。【方法】以20-E和JHA分别喂食不同发育时期(5龄第1,3和5天)的家蚕幼虫,以喂食蒸馏水的家蚕为对照,采用实时荧光定量PCR(realtime quantitative PCR)方法在处理后24和48 h对各组幼虫后部丝腺中PLP合成酶PLK和PNPO的转录水平进行分析。【结果】5龄第1天幼虫经20-E处理24和48 h后,PLK和PNPO的转录水平出现上调且与对照的差异达到极显著(P<0.01);5龄第3天幼虫经20-E处理,PLK的转录水平在48 h出现下调且与对照的差异达到显著(P<0.05),PNPO的转录水平在24和48 h均出现上调且与对照的差异达到极显著(P<0.01);5龄第5天幼虫经20-E处理后PLK和PNPO的转录水平无变化。5龄第1天幼虫经JHA处理后PLK和PNPO的转录水平未受到影响;5龄第3天幼虫经JHA处理后,PLK的转录水平在48 h出现显著下调且与对照的差异达到显著(P<0.05),PNPO的转录水平在24和48 h后均出现显著下调且与对照的差异达到极显著(P<0.05);5龄第5天幼虫经JHA处理24和48 h后,PLK和PNPO的转录水平出现下调且与对照的差异达到极显著(P<0.01)。【结论】20-E和JHA显著影响家蚕5龄幼虫PLK和PNPO的转录水平,20-E提高5龄前期家蚕PLK和PNPO的转录水平,JHA降低5龄后期它们的转录水平,为深入研究激素对VB_6的调控奠定基础。

摘要: 【目的】分析家蚕Bombyx mori受饥饿胁迫后的蛋白质谱变化,探索其耐受饥饿的机理。【方法】以家蚕品种932为实验材料,利用双向电泳和质谱技术检测5龄起蚕经过24 h饥饿胁迫的蛋白质谱差异变化,利用荧光定量PCR技术分析Bm Lp-c6的转录表达。【结果】经比对饥饿蚕和正常取食蚕的血淋巴蛋白谱,饥饿蚕有62个特异蛋白点。蛋白点的等电点在4.226.98之间,分子量分布在20.81144.69 k Da间。选取只在饥饿时出现的特异蛋白点No.7111进行质谱鉴定,根据其氨基酸序列进行引物设计,获得了目的基因Bm Lp-c6,经与载体p ET-21d(+)连接重组后,成功获得诱导表达。经实时荧光定量PCR分析,当5龄起蚕受到饥饿胁迫影响时,Bm Lp-c6基因在血淋巴中大量转录表达,但在中肠中的转录表达水平却极低。【结论】家蚕5龄起蚕在饥饿胁迫下,血淋巴中的蛋白质谱发生变化,Bm Lp-c6会大量转录表达。

摘要: 【目的】探索建立一种有效制备昆虫非典型嗅觉受体Orco抗原的方法,为Orco蛋白组织定位及功能研究奠定基础。【方法】设计带有Bam H I和Hind III酶切位点的引物,采用RT-PCR方法扩增家蚕Bombyx mori Orco第4-5跨膜区之间的基因片段,将其与原核表达载体p ET-28a(+)双酶切处理后进行连接,然后转化大肠杆菌Escherichia coli感受态细胞DH5α,重组质粒再转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,用IPTG诱导表达,用SDS-PAGE检测诱导蛋白,用His Trap HP亲和层析对诱导表达的大量蛋白进行纯化。【结果】在大肠杆菌原核表达系统中,用IPTG诱导获得了与预测蛋白大小相符的目的蛋白,经SDS-PAGE检测发现目的蛋白以包涵体形式表达,在变性条件下经His Trap HP亲和层析获得大量可用于抗体制备的纯化蛋白。【结论】利用原核表达系统可获得制备家蚕Orco抗体的抗原蛋白。

摘要: 【目的】家蚕Bombyx mori微粒子病是蚕业生产上的毁灭性病害,家蚕微孢子虫Nosema bombycis是该病的病原,可经卵垂直传播和经口水平传播。为了探索家蚕微孢子虫中对重复元件的抵御以及对基因转录调控的潜在方式,本研究拟在基因组水平上对该物种的小RNAs进行全面系统的分析,鉴定与转座子相关的小RNAs和潜在的miRNAs。【方法】从感染家蚕微孢子虫的家蚕中肠中提取总RNA,分离小片段RNA并反转录后,进行Solexa高通量测序。通过生物信息学方法对小RNAs进行分类及功能注释,鉴定起源于家蚕微孢子虫不同类型转座子的小RNAs,并对潜在的miRNA进行预测分析。【结果】家蚕微孢子虫小RNAs的长度主要是24和25 nt,其中大部分序列表现出5'末端的尿嘧啶偏好性。家蚕微孢子虫中存在丰富的与转座子相关联的小RNAs,并且与转座子标准序列匹配的反义小RNAs明显多于正义小RNAs。同时,鉴定获得了31个候选miRNAs,部分为Nosema属的其他孢子虫中所共有,暗示其在微孢子虫基因组进化上具有保守性。【结论】首次鉴定到家蚕微孢子虫的转座子相关性小RNAs,暗示小RNAs在家蚕微孢子虫基因组对转座子防御过程中起到作用,31个潜在的miRNAs为家蚕微孢子虫miRNAs的功能验证提供了后续靶标。