摘要: 【目的】对梨花迁粉蝶Catopsilia pyranthe分离的微孢子虫进行形态与分子鉴定,探究其对非天然宿主家蚕Bombyx mori的侵染力与胚传性。【方法】从田间采集的梨花迁粉蝶中分离得到梨花迁粉蝶微孢子虫液,测定其孢子的形态、大小、体积、长短轴比,同时对该孢子虫的16S r DNA进行PCR克隆测序与分析。将梨花迁粉蝶微孢子虫Nosema sp.CP与家蚕微孢子虫N.bombycis分别对2龄起蚕、4龄起蚕进行添食感染比对,测定家蚕食下两种微孢子虫的感染率和胚种传染能力。【结果】本研究分离的梨花迁粉蝶微孢子虫形态为长椭圆形,具双核;其16S r DNA序列与已报道的梨花迁粉蝶微孢子虫的序列一致性大于99%,为梨花迁粉蝶微孢子虫。梨花迁粉蝶微孢子虫和家蚕微孢子虫对家蚕综合感染率分别是68.8%和98.3%;在继代蚁蚕中,感染梨花迁粉蝶微孢子虫和家蚕微孢子虫的雌蛾所产蚕卵次代蚁蚕检出有孢子虫的检出率分别为100%和100%,卵壳的孢子虫的检出率分别为92.9%和100%;梨花迁粉蝶微孢子虫和家蚕微孢子虫对家蚕的胚种传染力分别为9.6%和23.2%。【结论】本研究分离得到的微孢子虫为梨花迁粉蝶微孢子虫,具有微孢子虫Nosema属的典型特征。梨花迁粉蝶微孢子虫能感染危害家蚕,也具有家蚕胚种传染性,但感染率和胚传率均明显低于家蚕微孢子虫,是蚕业生产中必须防控的对象。

摘要: 【目的】家蚕Bombyx mori凋亡蛋白抑制因子(BmIAP)是在家蚕中发现的一个凋亡蛋白抑制因子(IAP)。本研究旨在验证家蚕BmIAP蛋白在家蚕细胞内的功能特征,以进一步研究BmIAP在家蚕细胞凋亡中的作用。【方法】对构建的瞬时表达载体PIZ/V5-BmIAP-dsRed,应用脂质体转染家蚕Bm N-SWU1细胞;应用实时荧光定量PCR和Western blot分析BmIAP mRNA及蛋白表达水平;通过150 ng/m L放线菌素D诱导家蚕Bm N-SWU1细胞12,18和24 h,应用免疫荧光及实时荧光定量PCR方法,分析BmIAP瞬时表达与细胞凋亡的关系。【结果】构建的瞬时表达载体PIZ/V5-BmIAP-dsRed能在家蚕Bm N-SWU1细胞表达BmIAP蛋白,其BmIAP mRNA表达水平上调近45倍,融合蛋白约为60 k D;BmIAP基因瞬时表达72 h后,BmIAP能显著抑制放线菌素D诱导12 h时的家蚕Bm N-SWU1细胞凋亡。【结论】BmIAP蛋白在家蚕细胞中能抑制家蚕细胞凋亡,是家蚕的一种凋亡蛋白抑制因子。

摘要: 【目的】在分子层面上研究家蚕微孢子虫Nosema bombycis与家蚕Bombyx mori蛋白的相互作用,初步探讨家蚕微孢子虫向家蚕细胞能量中心靠近的原因。【方法】采用Far-western blot分析与家蚕微孢子虫具有相互作用的家蚕中肠蛋白,质谱鉴定筛选出候选蛋白。PCR扩增候选蛋白的基因,连接到p ET30a载体并转入大肠杆菌Escherichia coli DH5α感受态细胞培养,测序选取正确的3个重组质粒,转化到大肠杆菌E.coli BL21感受态细胞中诱导表达候选蛋白,亲和层析柱纯化候选蛋白,制备多克隆抗体。用免疫共沉淀和间接免疫荧光技术验证候选蛋白与家蚕微孢子虫的相互作用。【结果】Far-western blot筛选到的anti-SWP9和anti-SWP5抗体与感染家蚕微孢子虫的家蚕中肠总蛋白的PVDF膜孵育,分别在26 k D和34 k D处检测到一条特异条带,说明家蚕微孢子虫与26 k D和34 k D的家蚕中肠蛋白发生了相互作用。对质谱鉴定结果进行蛋白质的分子量、肽段数以及功能的分析,筛选出与家蚕微孢子虫相互作用的候选家蚕蛋白烯酰辅酶A水合酶(ECH1)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)和3-羟酰辅酶A脱氢酶(HCDH)。利用制备的能够特异识别ECH1,GAPDH和HCDH 3种蛋白的多克隆抗体anti-ECH1,anti-GAPDH和anti-HCDH进行免疫共沉淀,证实了家蚕微孢子虫与家蚕中肠蛋白ECH1和GAPDH具有相互作用;间接免疫荧光分析结果进一步说明GAPDH能与家蚕微孢子虫特异性结合。【结论】家蚕微孢子虫可以和家蚕蛋白ECH1和GAPDH特异性结合。由于ECH1是定位于线粒体膜上的脂肪酸β-氧化的关键酶,GAPDH是糖酵解途径的关键酶,推测家蚕微孢子虫可能通过和家蚕ECH1和GAPDH的相互作用,在空间上靠近宿主细胞的线粒体和糖酵解途径,便于摄取宿主细胞脂肪酸β-氧化和糖酵解途径产生的中间产物和ATP,满足家蚕微孢子虫的物质和能量需求。

摘要: 【目的】研究氟化钠(NaF)对鳞翅目模式生物家蚕Bombyx mori精巢和卵巢组织的形态结构以及抗氧化酶活性及其基因mRNA表达的影响,旨在探讨NaF对昆虫的生殖腺损伤及其机理。【方法】给家蚕幼虫添食不同浓度NaF溶液(0,25,50,100,200 mg/L)浸泡过的桑叶,调查不同性别家蚕5龄幼虫生殖腺中脂质过氧化物丙二醛(MDA)的含量,超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性及其基因转录表达水平的变化,并通过石蜡切片、HE染色技术观察了生殖腺结构变化情况。【结果】与对照组相比,NaF对雌雄家蚕MDA含量均具有浓度-效应关系,MDA含量随NaF添食浓度的升高而增加。随着NaF添食浓度的增加,SOD和CAT活性都表现为先升高后降低的变化趋势,但均高于对照组。Pearson相关性分析显示,SOD和CAT酶活性变化有显著相关性(雄:R=0.865,P=0.000;雌:R=0.766,P=0.001),雌雄CAT酶活性与其基因mRNA表达水平也具有正相关性。雌雄家蚕生殖腺中GSH-Px活性随着NaF添食浓度的升高而增加,显示浓度-效应关系,其酶活性与gsh-px的mRNA水平的表达具有显著相关性。不同性别家蚕在添食NaF后,雄性的抗氧化酶活性变化较雌性更为敏感。HE染色观察到雌雄生殖腺的形态结构发生变化,表现为形态畸形,细胞内空泡增大,生殖细胞数目相对减少。且伴随着NaF添食浓度的增加,生殖腺损伤越严重。【结论】家蚕幼虫添食NaF不仅引起其雌雄生殖腺的结构发生改变,而且还导致其生殖腺中的抗氧化酶活性及其基因mRNA转录水平发生变化。

摘要: 【目的】家蚕Bombyx mori翅原基在生长分化过程中伴随着造血器官和翅囊等组织的消失。本研究旨在分析家蚕翅原基生长分化过程中是否存在细胞凋亡和细胞自噬。【方法】制作蛹期0 d翅原基石蜡切片,利用TUNEL法检测细胞凋亡情况;提取5龄第3天、5龄第6天、上簇第1天、预蛹期、蛹期0 d及蛹期第3天的翅原基总RNA,反转录成c DNA,利用定量PCR检测凋亡和自噬相关基因的表达水平;检测了细胞凋亡相关的Caspase 3和细胞自噬相关的酸性磷酸酶活性。【结果】TUNEL染色发现蛹期0 d的翅原基出现部分细胞凋亡现象;细胞凋亡相关基因Caspase 3和Nc主要在5龄幼虫期有高水平表达,细胞凋亡抑制因子IAP主要在幼虫末期有较高水平的表达;Caspase 3酶活性在上簇第1天出现峰值;细胞自噬相关基因Atg5,Atg6,Atg8和Atg12主要在幼虫末期有较高水平的表达;酸性磷酸酶活性也主要在幼虫末期较高。【结论】在幼虫期可能存在细胞凋亡,抑制了翅原基细胞的增殖,进而阻止了翅原基的生长分化;在幼虫末期可能同时存在细胞凋亡和自噬,促进翅囊等的退化,同时阻止了翅原基细胞的增殖,推动了翅原基向蛹翅的发育。