摘要: 【目的】昆虫鞣化激素(Bursicon)是由神经系统分泌的一种异源二聚体神经肽,对昆虫表皮鞣化、翅展等功能具有调控作用。本研究旨在探究鞣化激素基因与家蚕Bombyx mori翅发育及对繁殖力相关基因的关系,明确其对翅展和繁殖力的调控作用。【方法】采用RNAi技术,分别注射Bursicon基因的dsRNA(dsBmBurs-α, dsBmBurs-β和dsBmBurs-α+dsBmBurs-β)到家蚕1日龄蛹,以注射dsGFP为对照。观察RNAi后家蚕表型,并计算家蚕单雌产卵量;利用实时定量PCR技术检测Bursicon基因RNAi后家蚕羽化后24 h成虫中翅发育相关基因(BmWg,BmFt,BmFj和BmDs)和RNAi 48和72 h后家蚕蛹中繁殖相关基因(卵黄原蛋白基因BmVg和卵黄原蛋白受体基因BmVgR)的表达水平。【结果】家蚕Bursicon基因被RNAi后,羽化后24 h的家蚕翅不能正常伸展,dsBmBurs-α,dsBmBurs-β和dsBmBurs-α+dsBmBurs-β处理组的翅畸形率分别为93.33%, 96.67%和96.43%;平均单雌产卵量分别为312.67, 332.00和284.00粒,显著低于对照组(406.00粒)。RNAi干扰Bursicon基因后,家蚕Bursicon基因BmBurs-α和BmBurs-β表达量显著下调,其相关基因BmWg,BmFt,BmFj,BmDs,BmVg和BmVgR的表达水平均显著低于对照组。【结论】鞣化激素基因参与调节家蚕翅发育相关基因的转录水平来调控翅展。同时,它们还可以参与调节繁殖相关基因BmVg和BmVgR的表达,从而影响家蚕的繁殖。

摘要: 【目的】雌激素雌二醇(E_2)在脊椎动物中通过雌激素受体(ER)调节脊椎动物的生长发育和繁殖。昆虫中并没有ER,但有研究显示某些昆虫能对E_2产生一定的应答。本研究在明确E_2能影响家蚕Bombyx mori卵黄原蛋白基因(BmVg)表达的前提下,分析其对这一基因表达的调控机制。【方法】取BmVg高量表达时的家蚕雌性幼虫(上蔟后60 h)脂肪体,用不同浓度(0.001,0.05,0.5,5和50 nmol/L)E_2处理后,通过qRT-PCR检测BmVg表达的变化,分析家蚕对E_2的应答;克隆家蚕蜕皮激素受体基因(BmEcRB1),构建原核表达载体,表达并纯化BmEcRB1蛋白后与E_2体外孵育,通过微量热泳动仪(MST)分析E_2与BmEcRB1的结合情况。【结果】不同浓度E_2均显著抑制离体培养的雌蚕脂肪体中BmVg基因的表达。MST实验证实,E_2与BmEcRB1具有一定的亲和力,解离常数(Kd)为77.8±22μmol/L。【结论】结果说明,E_2对BmVg表达的影响是通过与蜕皮激素(20E)竞争性结合BmEcRB1实现的。

摘要: 【目的】研究双重氧化酶(dual oxidase,DUOX)在家蚕Bombyx mori中的表达模式,探析其在家蚕肠道免疫机制中的作用。【方法】通过氨基酸多重序列比对和系统进化分析对Bm DUOX蛋白氨基酸序列特征进行研究,并采用RT-PCR方法扩增获得家蚕Bm DUOX膜外部分Bm DUOX_OM基因序列。在大肠杆菌Eescherichia coli(DE3)中诱导表达并通过亲和层析法纯化获得重组表达蛋白,以其为抗原免疫昆明鼠,获得对应的多克隆抗体;利用所得的抗体检测Bm DUOX的表达和细胞定位。通过半定量RT-PCR方法分析Bm DUOX在家蚕不同发育时期和组织中的表达模式及病原诱导表达谱。另外,利用活性氧检测试剂盒分析家蚕微孢子虫Nosema bombycis诱导后家蚕Bm E细胞的活性氧(ROS)的含量。【结果】生物信息学分析表明,Bm DUOX内有保守的Peroxidase,Ferric_reduct,EF-hand,FAD-binding和NAD-binding结构域,且具有6个跨膜区,跨膜形式与人类Homo sapiens、果蝇Drosophila melanogaster等的DUOX蛋白的跨膜形式一致。多重序列比对分析表明,Bm DUOX的过氧化酶区域内具有过氧化物酶的保守活性位点。克隆获得家蚕Bm DUOX_OM基因,并纯化获得重组表达蛋白,制备的鼠多抗具有较好的特异性。间接免疫荧光实验(IFA)表明,Bm DUOX位于家蚕Bm E细胞的细胞膜上。表达模式分析表明,Bm DUOX在家蚕5龄第3日幼虫和成虫中表达量较高;且在幼虫表皮、精巢、卵巢和头内高量表达,在成虫的卵巢、精巢、表皮和脂肪体内也有较高的表达量。病原诱导分析表明,通过肠道起始感染的家蚕微孢子虫能够诱导家蚕幼虫中肠Bm DUOX基因持续上调表达,且其诱导后的Bm E细胞内活性氧含量也明显增加,提示Bm DUOX调控的肠上皮ROS应答参与抵抗家蚕微孢子虫的侵染。【结论】Bm DUOX含有典型的结构域及保守的活性位点,表明其在家蚕中具有保守的生物学功能。Bm DUOX在家蚕不同发育时期、不同组织及病原诱导下的表达谱提示其可能参与宿主肠上皮对家蚕微孢子虫的免疫反应。

摘要: 【目的】麻痹肽(paralytic peptide,PP)是一种在鳞翅目昆虫血淋巴中鉴定到的Glu-Asn-Phe(ENF)肽,将其注入幼虫体内会引发快速僵化的紧张性收缩。本研究旨在确定PP引起家蚕Bombyx mori幼虫活体收缩的最适剂量和最大收缩幅度,并检测诸如背血管搏动速率和离子浓度等可能伴随收缩现象的其他生理指标的变化。【方法】向家蚕5龄幼虫注射不同剂量的PP后,监测其体长收缩幅度和背血管博动速率,并用原子吸收光谱测定血淋巴、脂肪体和肠道的离子浓度。【结果】浓度为50 ng/g动物时,PP引发最有力收缩且不会导致家蚕死亡。最大收缩出现在注射后45 min内,同时肠道出现不正常扭曲以及背血管脉动速率下降。此外,细胞外Ca(2+)是收缩所必需的,PP刺激还导致血淋巴中Cl-浓度急剧下降而后缓慢恢复。【结论】PP的致麻痹活动不仅引起身体收缩,还会影响家蚕幼虫的肠道和背血管的脉动,而且破坏Cl-的体内平衡。研究结果为在动物模型中研究PP的生理功能提供参考。

摘要: 【目的】发现昆虫精巢干细胞自我更新相关基因3'UTR上的保守miRNA靶位点,为深入研究昆虫精子发生进程中的miRNA-基因调控关系提供参考。【方法】使用Blast搜索27种全变态昆虫精巢干细胞自我更新相关基因,并预测这些基因的3'UTR。使用Target Scan预测这些基因3'UTR上的miRNA靶位点。对家蚕Bombyx mori和小菜蛾Plutella xylostella的Chinmo和Imp基因包含let-7-5p靶标点的3'UTR序列进行了克隆,使用双荧光素酶报告系统对其靶标关系进行验证。【结果】在27种全变态昆虫中发现了17个精巢干细胞自我更新相关基因。利用Target Scan在这些基因的3'UTR上预测到了203个保守的miRNA靶位点。其中Zfh-1,Chinmo,Ken及Imp的3'UTR上存在大量的miRNA靶位点,但miRNA靶位点数目在不同昆虫类群中也存在很大差异。其中,Chinmo及Imp 3'UTR上的let-7-5p靶位点在昆虫中保守。分别克隆了家蚕和小菜蛾Chinmo和Imp的3'UTR,通过双荧光素酶报告系统转染239T细胞证实了let-7-5p对Chinmo和Imp两个基因的调控作用。【结论】发现在4个昆虫精巢干细胞自我更新相关基因Zfh-1,Chinmo,Ken和Imp的3'UTR上存在大量的miRNA靶标位点。其中Chinmo及Imp基因3'UTR上let-7-5p靶位点在大多数全变态昆虫中保守,双荧光素酶报告系统实验证实了家蚕和小菜蛾中let-7-5p与Chinmo和Imp存在相互作用,为进一步研究miRNA在昆虫精子发生进程中的功能提供了参考。