摘要: 【目的】血细胞是昆虫血淋巴免疫的主导者。调查家蚕Bombyx mori幼虫血细胞密度变化和成因、血细胞密度与家蚕抗性的关系，是研究家蚕血细胞相关的免疫调控和抗性育种的重要组成。【方法】用细胞计数板统计家蚕品种大造不同龄期(4龄第1-4天、5龄第1-8天和上蔟期)幼虫10μL血淋巴中的血细胞数目并计算血细胞密度，利用ImageJ软件估算横截面成像图面积来代表造血器官相对体积；用细胞计数板统计不同家蚕品种(菁松、皓月、两广二号、932、芙蓉、7532和湘辉)5龄第1天幼虫血淋巴中的血细胞数目；用qRT-PCR分析皓月和两广二号5龄第1天幼虫血淋巴中造血调控因子基因BmBCFI,BmUsh,BmGATA和BmLz的相对表达量；大肠杆菌Escherichia coli侵染大造5龄第1和3天幼虫不同时间后，用细胞计数板统计血淋巴中血细胞数目，用qRT-PCR检测血淋巴中上述造血调控因子基因的表达量；BmBCFI,BmUsh和BmLz被RNAi干扰不同时间后，qRT-PCR检测大造5龄幼虫血淋巴中靶基因的相对表达量；BmBCFI,BmUsh和BmLz被RNAi干扰48 h后大肠杆菌侵染6 h时用qRT-PCR检测大造5龄幼虫血淋巴中靶基因和免疫相关基因BmRelish,BmCactus,BmSpzl,BmPGRP-LE的相对表达量，用细胞计数板统计血淋巴中不同类型血细胞数目；35℃高温饲养12个实用家蚕品种5龄幼虫，分析血细胞数目和生存力之间的关联性。【结果】4龄期大造幼虫血细胞数目随生长逐渐上升，到5龄第1天达到顶峰，5龄第2天开始下降，直至上蔟期出现小幅升高；造血器官在5龄前中期随幼虫生长逐渐增大，5龄第6天体积达到最大，随后显著变小直至完全解离，其大小变化与血细胞数目变化时间和趋势不一致。血细胞数目多的两广二号中造血调控因子基因BmBCFI,BmUsh和BmLz的表达量均高于在血细胞数目少的皓月中，在大肠杆菌侵染后大造5龄幼虫血细胞数目达到高峰时BmBCFI,BmUsh和BmLz被显著上调表达。RNAi干扰后大肠杆菌侵染下调BmLz或BmUsh表达时，拟绛色细胞数目显著减少；而RNAi干扰后大肠杆菌侵染下调BmBCFI表达时，浆细胞数目和血细胞总数显著减少。RNAi干扰后大肠杆菌侵染下调BmBCFI或BmUsh表达时，Imd通路上BmRelish和Toll通路上BmCactus的表达量都显著下降，暗示BmBCFI和BmUsh与NF-κB信号通路激活、抗菌肽等免疫因子形成有关。不同家蚕品种间血细胞数目差异极大，有夏秋用品种的血细胞数目比春用品种高的趋势。在35℃高温饲养条件下，实用品种5龄幼虫血细胞数目与5龄幼虫死亡指数值呈负相关。【结论】家蚕造血调控因子基因的表达量影响血细胞密度，BmUsh和BmLz影响家蚕拟绛色细胞密度，BmBCFI与家蚕浆细胞形成有关。此外，BmBCFI和BmUsh可能与家蚕NF-κB信号通路激活有关，血细胞密度与高温饲养家蚕幼虫生存力呈正相关。

摘要: 【目的】本研究探讨使用人工饲料部分替代桑叶饲育后家蚕Bombyx mori幼虫肠道细菌群落的变化情况，并分析人工饲料替代桑叶的不同饲育模式下肠道关键细菌与蛹重和茧层量的相关性，为人工饲料部分替代法饲育家蚕的实际应用提供理论依据。【方法】采用全龄桑叶育(Mul1-5)、1-2龄人工饲料育+3-5龄桑叶育(Art1-2)、1-3龄人工饲料育+4-5龄桑叶育(Art1-3)、1-4龄人工饲料育+5龄桑叶育(Art1-4)和全龄人工饲料育(Art1-5) 5种饲养模式饲养家蚕幼虫，统计5种饲养模式下家蚕的全茧量、茧层量及蛹重；收集不同饲养模式下家蚕5龄幼虫肠道样品，通过高通量测序技术分析其肠道菌群的组成和多样性差异，采用Spearman相关性热图分析肠道细菌与蛹重和茧层量的相关性。【结果】人工饲料与桑叶不同搭配的饲育模式对家蚕茧质有显著的影响，Mul1-5和Art1-5的全茧量最高，二者无显著性差异，Art1-2其次；Mul1-5茧层量最高，Art1-2其次，Art1-5茧层量最低。在不同饲育模式下，家蚕肠道细菌多样性和组成显著不同：在门水平上，Art1-2和Mul1-5的细菌组成最相近，优势菌主要是变形菌门(Proteobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes),而Art1-3, Art1-4和Art1-5的细菌组成最相近，变形菌门丰度随着人工饲料饲养时间的增加逐渐增加，厚壁菌门的丰度则呈现相反的趋势；在属水平上，家蚕肠道优势菌属有假单胞菌属Pseudomonas、肠球菌属Enterococcus、鞘脂单胞菌科未分类菌属Sphingomonadaceae unclassified及罗尔斯通菌属Ralstonia等。不同饲育模式下家蚕肠道菌属丰度差异最大的是肠球菌属，Art1-2组中肠球菌属丰度最高(40.9%),随着人工饲料饲养时间的延长，丰度逐渐降低，在Art1-5中仅为0.02%。家蚕肠道菌群大部分关键物种均与茧质呈一定的相关性：柯克斯体属Coxiella与蛹重呈显著正相关，与茧层量呈显著负相关；葡萄球菌属Staphylococcus与蛹重呈显著负相关；肠球菌属与茧层量呈显著正相关。【结论】饲育模式Art1-2最接近于Mul1-5,可为人工饲料部分替代桑叶饲育法饲育家蚕提供参考。人工饲料部分替代桑叶后家蚕肠道菌群结构发生了显著变化，肠球菌属丰度的显著降低及假单胞菌属的显著增加可能与全龄人工饲料养家蚕体质弱有关；一些关键细菌与家蚕蛹重和茧层量存在显著相关性，其影响机制需要进一步研究。

摘要: 【目的】本研究旨在通过对家蚕Bombyx mori 5龄幼虫精巢和卵巢组织微小RNA (microRNA, miRNA)基因芯片及转录组进行分析,找到参与家蚕性腺发育相关的miRNA分子及可能的靶基因。【方法】采用新一代高通量测序平台对家蚕5龄幼虫精巢和卵巢(分别定义为Test和Control)进行miRNA基因芯片检测及转录组测序分析,根据P<0.05且log_2(fold change, FC)≥2的标准,通过比较筛选出Test vs Control的差异表达miRNA;根据q≤0.05且|log_2(fold change)|≥1的标准,通过比较筛选出Test vs Control的差异表达基因(differentially expressed genes, DEGs);随机选取8个上调和12个下调差异表达miRNA,对其表达及其预测的5个靶基因进行qRT-PCR验证;对DEGs以及差异表达miRNA的靶基因进行KEGG通路富集分析。【结果】从精巢和卵巢样本中(Test vs Control)分别鉴定出68个差异表达miRNA和3 991个DEGs,其中上调和下调miRNA分别为36和32个,上调和下调DEGs分别为2 033和1 958个。差异表达miRNA的qRT-PCR验证结果均与芯片数据一致。KEGG通路富集分析结果显示DEGs在新陈代谢及核糖体的信号通路显著富集。对差异表达miRNA在DEGs中的可能靶基因进行预测,结果找到了4组表达趋势相反的miRNA与靶基因:分别是bmo-miR-2774a与LOC101745556;bmo-miR-92b与LOC101735954以及bmo-miR-3266与LOC733130和LOC778467;1组表达趋势一致的miRNA与靶基因:bmo-miR-3321与LOC101744895。5个靶基因的qRT-PCR验证结果与转录组测序结果一致。【结论】本研究获得了家蚕5龄幼虫精巢和卵巢转录组及miRNA芯片数据,筛选并验证了4组差异表达和1组一致表达miRNA及潜在靶基因,为探究家蚕精巢和卵巢发育差异奠定了基础。

摘要: 【目的】长链非编码RNA(long non-coding RNA, lncRNA)对家蚕Bombyx mori发育具有重要调控作用。我们在前期研究中发现一个位于家蚕丝素蛋白基因P25附近的lncRNA BmlncR2036。本研究旨在进一步探索BmlncR2036调控家蚕P25基因表达的分子机制。【方法】qPCR检测BmlncR2036在5龄第3天家蚕幼虫不同组织(体壁、脑、神经、精巢、卵巢、丝腺、马氏管、血淋巴、脂肪体和中肠)中和不同发育阶段前丝腺、中丝腺和后丝腺中的表达谱。预测能够同时靶向P25和BmlncR2036的miRNA,利用荧光素酶检测法验证miRNA与P25互作关系。荧光素酶检测法测定BmlncR2036对P25基因启动子转录活性的影响。在家蚕5龄第3天幼虫中注射dsRNA敲低BmlncR2036的表达,观察丝腺及中肠表型的变化。【结果】qPCR结果显示,BmlncR2036在家蚕5龄第3天幼虫和5龄熟蚕的后丝腺中高表达,与P25基因呈现一致的表达趋势;BmlncR2036在家蚕5龄第3天幼虫的精巢和中肠中高表达,在其他组织中表达量较低,暗示其功能的多样性。miR-2739和miR-279a既能够与BmlncR2036匹配,也可能靶向P25基因的3′UTR。但荧光素酶检测法结果显示P25不是miR-2739和miR-279a的真实靶标。BmlncR2036负调控P25启动子活性,共转染pcDNA3.1(+)[BmlncR2036]和pGL3-Enhancer[P25-promoter]载体后,细胞荧光素酶活性极显著下降了52%。在家蚕5龄第3天幼虫中敲低BmlncR2036表达后出现体色变暗,中肠残留大量内容物,直至死亡的现象,表明BmlncR2036可能参与家蚕中肠的发育调控。【结论】发现lncRNA BmlncR2036可调控P25基因启动子活性,还可能参与调控家蚕中肠的发育。本研究为进一步探索家蚕lncRNA的功能提供了实验依据。

摘要: 【目的】明确基于电穿孔的基因功能分析方法在家蚕Bombyx mori活体内的应用实效。【方法】针对调控家蚕幼虫体表斑纹黑色素合成的靶基因Wnt1 (Wingless),人工合成特异性siRNA,向4龄第3天家蚕幼虫注射Wnt1 siRNA并进行电穿孔作为处理组(ERFA-RNAi),以注射Wnt1 siRNA但未进行电穿孔的幼虫作为阴性对照组(negative control, NC),解剖5龄幼虫斑纹区的表皮,用实时定量RT-PCR测定表皮中Wnt1的相对表达量,验证电穿孔介导的RNAi效果。带有增强型绿色荧光蛋白报告基因EGFP和红色荧光蛋白报告基因DsRed2表达元件的转座子载体pPIG-A3GR,通过电穿孔导入家蚕2龄幼虫;正常饲养72 h后,用荧光体视显微镜观察幼虫中EGFP和DsRed2的表达,验证当世代家蚕的嵌合体转基因。【结果】家蚕4龄第3天幼虫中导入Wnt1的特异性siRNA后,5龄幼虫体表特定部位斑纹的形成明显受到抑制,实时定量RT-PCR分析表明5龄幼虫表皮中Wnt1的表达水平显著降低。嵌合体转基因家蚕的阳性率达56.60%,并且两个荧光报告基因EGFP和DsRed2在幼虫、蛹及成虫期持续表达。【结论】电穿孔技术可快捷、高效地向家蚕活体内导入外源RNA或DNA,是家蚕乃至其他昆虫基因功能解析的有效方法。