摘要: 【目的】克隆家蚕Bombyx mori Wnt信号通路下游关键基因Pangolin isoforms A/H/I/S转录剪接体X3 (Pangolin X3),分析其序列和表达特征。【方法】从NCBI数据库检索家蚕Pangolin X3,根据其编码序列(coding sequence, CDS)设计引物，利用PCR从家蚕幼虫中肠和血淋巴中进行克隆并测序验证。利用SilkDB 3.0, SMART,多序列比对和系统发育树分析Pangolin X3的序列特征。利用qRT-PCR分析Pangolin X3在家蚕5龄第3天幼虫不同组织(头、血淋巴、体壁、性腺、中肠、前部丝腺、中部丝腺、后部丝腺、脂肪体和马氏管)中的相对表达水平。【结果】从家蚕幼虫中肠和血淋巴克隆了Pangolin X3(GenBank登录号：XM＿038020921)的CDS,其开放阅读框长1 560 bp,编码519个氨基酸残基，预测分子量为55.86 kD,预测等电点为7.53。Pangolin X3蛋白含有保守的β-catenin结合位点和HMG结构域，其氨基酸序列在不同的昆虫中比较保守，特别是与DNA结合的HMG结构域，而与β-catenin结合的N末端CTNNB1结构域部分氨基酸残基发生变异。组织表达谱显示，Pangolin X3在家蚕5龄第3天幼虫中肠、血淋巴和性腺中的相对表达水平较高，在头、体壁、前部丝腺、中部丝腺、后部丝腺、脂肪体和马氏管中的相对表达水平较低。【结论】本研究克隆了家蚕Pangolin X3,分析了其序列和表达特征，为深入研究家蚕Pangolin的生物学功能提供了基础。

摘要: 【目的】家蚕Bombyx mori非滞育红卵突变体Re-nd是唯一在非滞育状态下卵色呈现鲜红色的突变品种。本研究通过基因连锁分析和定位克隆的方法确定Re-nd的突变基因所在的染色体及紧密连锁位置，为后续Re-nd的功能研究及应用奠定基础。【方法】以家蚕卵色突变体Re-nd和野生型大造进行杂交，配制基因连锁分析群体材料和定位克隆群体材料；针对家蚕全染色体进行SNP标记开发，利用BC_1代群体材料进行基因连锁分析，确定Re-nd的突变基因所在的染色体；针对定位的Re-nd的突变基因所在染色体进行SNP标记开发，利用BC_1群体材料对Re-nd的突变基因进行定位克隆。【结果】基因连锁分析结果显示Re-nd的突变表型与第6号染色体上的SNP标记完全连锁；初步定位克隆结果显示Re-nd的突变基因位于SNP标记SNP7和SNP17之间，物理距离4.04 Mb;以SNP7和SNP17之间筛选出的6个SNP标记和25个重组个体进行精细定位克隆，结果显示Re-nd的突变基因所在的区域位于SNP10和SNP12两个SNP标记之间的nscaf2853上，物理距离949.3 kb左右。【结论】将Re-nd的突变基因定位于第6号染色体的2个SNP标记SNP10和SNP12之间，物理距离约949.3 kb。本研究为后续Re-nd突变基因的精细定位及功能应用研究奠定了基础。

摘要: 【目的】阐明生存素基因在家蚕Bombyx mori BmN4细胞有丝分裂中的功能。【方法】qRT-PCR分析家蚕生存素基因BmSurvivin在家蚕5龄第3天幼虫不同组织(丝腺、中肠、马氏管、精巢、卵巢、脂肪体、皮细胞层和表皮)中的表达量；构建pIZT/V5-His-BmSurvivin-GFP(BG)融合载体并转染BmN4细胞，以免疫荧光标记检测BmSurvivin和第10位丝氨酸(Ser10)磷酸化的组蛋白H3(H3Ser10ph)在BmN4细胞有丝分裂分裂不同时期的定位。【结果】BmSurvivin在家蚕5龄第3天幼虫马氏管中表达量最高，其次是在丝腺和中肠中。成功构建pIZT/V5-His-BmSurvivin-GFP载体。免疫荧光结果显示，在BmN4细胞间期核中可以看到明显的GFP信号，涵盖了细胞核和细胞质区域，指示BmSurvivin的定位；随着细胞进入分裂期，GFP信号指示BmSurvivin与染色质共定位，待细胞形成明显的双取向时在纺锤体区域也可以看到GFP信号；后期随着姐妹染色单体分开，GFP信号指示BmSurvivin定位在染色质及胞质分裂区；末期随着两个新的子细胞形成GFP信号指示BmSurvivin仅定位在胞质分裂区。H3Ser10ph定位在BmN4细胞前中期染色质凝缩处，至中期信号最强，与整条染色体重合，后期信号消失。【结论】BmSurvivin与有丝分裂周期中染色质和纺锤体的动态变化相关。

摘要: 【目的】本研究旨在通过对一个新的长链非编码RNA (long non-coding RNA, lncRNA)及其共表达基因在家蚕Bombyx mori中的表达和功能进行分析，进一步阐明lncRNA在调控家蚕变态发育中的分子机制。【方法】基于前期家蚕脂肪体转录组测序数据，我们发现在蜕皮激素20E(2μg/μL)处理5龄幼虫早期的脂肪体中lncRNA63表达显著上调，家蚕激素受体基因Hr3与之共表达。利用qRT-PCR对lncRNA63和Hr3在家蚕不同发育时期(4-5龄幼虫、蛹和成虫)、5龄幼虫不同组织(头、体壁、血淋巴、中肠、马氏管、脂肪体、丝腺、精巢和卵巢)和2μg/μL 20E处理2, 6, 12和24 h后5龄幼虫脂肪体中的表达谱进行分析；采用核质分离检测和原位杂交技术检测lncRNA63在家蚕BmN细胞中的定位；利用dsRNA干涉家蚕5龄幼虫个体中lncRNA63的表达，并利用qRT-PCR检测RNA干涉lncRNA63对头、丝腺、脂肪体和体壁中Hr3表达的影响。【结果】qRT-PCR结果表明，lncRNA63和Hr3在家蚕羽化前的蛹末期有一个表达高峰；二者在家蚕5龄幼虫头、体壁和丝腺中都有较高表达；lncRNA63和Hr3在2μg/μL 20E处理2, 6和12 h的家蚕5龄幼虫脂肪体中较对照组(无水乙醇处理组)都显著上调，24 h下降到与对照组相当水平，二者的表达趋势完全一致。LncRNA63主要定位于BmN细胞核，但20E可诱导lncRNA63的核质迁移。利用dsRNA干涉lncRNA63表达后，Hr3的表达显著下调。【结论】20E不仅可调控lncRNA63的表达，还可诱导lncRNA63的核质迁移；lncRNA63可通过调控共表达基因Hr3的表达参与家蚕的变态发育过程。

摘要: 【目的】本研究旨在探索DNA甲基化是否通过调控细胞自噬进而影响家蚕Bombyx mori翅的发育。【方法】分别用1和2μg DNA甲基化特异性抑制剂5-aza-dC处理家蚕卵巢Bm12细胞和家蚕预蛹，荧光显微镜下观察Bm12细胞的数量，利用dot blot检测Bm12细胞中DNA甲基化水平，利用溶酶体染色检测细胞自噬强度；利用RT-qPCR检测细胞自噬相关蛋白(Agt)基因的表达水平；利用Western blot和免疫组化定性检测Bm12细胞中自噬标记物LC3蛋白的分型情况；观察成虫的翅表型并计算残翅率和翅面积。用2μg细胞自噬激活剂SMER28处理家蚕预蛹，以及采用自噬抑制剂Spautin-1(2μg)挽救5-aza-dC (2μg)处理后的家蚕预蛹，利用溶酶体染色检测翅细胞内自噬强度，观察翅表型并计算残翅率和翅面积。【结果】1μg 5-aza-dC处理后12, 24和48 h抑制了Bm12细胞的生长，使Bm12细胞甲基化水平降低，Bm12细胞自噬水平升高；处理后48 h Bm12细胞中Atg基因表达上调。家蚕预蛹期注射2μg 5-aza-dC后24, 48和72 h,成虫翅细胞内自噬水平升高，Atg基因的表达上调，出现大量畸形翅并且残翅率升高72.62%和翅表面积减少66%。家蚕预蛹期注射2μg SMER28 24, 48和72 h后，成虫翅细胞内自噬水平升高，成虫出现大量畸形翅，残翅率升高75.13%和翅表面积减少48.79%。利用Spautin-1对5-aza-dC处理的预蛹进行挽救实验，结果显示细胞自噬抑制可以缓解DNA去甲基化对成虫翅发育的影响。【结论】本研究结果证明DNA甲基化通过调节细胞自噬在家蚕翅发育中发挥作用。本研究结果为DNA甲基化调控昆虫发育提供了实验依据。