摘要: 【目的】fruitless(fru)是昆虫求偶和交配行为中的关键基因,但是其在桔小实蝇Bactrocera dorsalis中的具体功能尚不清楚。本研究旨在明确fru在桔小实蝇求偶交配行为中的作用,进一步明确fru的生物学意义。【方法】根据NCBI上桔小实蝇fru的预测序列设计两端引物,以桔小实蝇羽化10 d已交配的成虫头部cDNA为模板克隆fru基因的全长cDNA,并对其编码蛋白的结构域进行预测。通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术检测该基因在桔小实蝇交配前后表达量的变化。待合成fru基因的dsRNA后,注射到羽化9 d后的桔小实蝇雄成虫腹部进行RNAi,分别于注射后48 h和72 h取样,检测fru基因的相对表达量;并于RNAi后72 h进行求偶交配行为观察,测定桔小实蝇的交配频率和交配持续时间。【结果】克隆获得桔小实蝇fru的全长cDNA,长2 865 bp,编码954个氨基酸,预测蛋白分子量104.1 kD,等点为6.01。该基因所编码的蛋白具有特殊结构域,分别为一个BTB (Broad-complex, Tramtrack and Bric-a-bric)结构域和两个锌指(zinc finger)结构域。RT-qPCR结果表明,相比未交配的桔小实蝇成虫,fru基因在雄成虫头部中的表达量在与雌成虫交配后显著上升。相对于空白对照组(注射DEPC水)和阴性对照组(注射dsGFP),注射dsfru的RNAi处理组的雄性求偶时间延长(延长了2535 min),且交配频率下降(降低了17%22%),说明fru基因在雄性桔小实蝇的求偶交配行为中发挥着重要作用。【结论】本研究结果为明确fru在非模式昆虫桔小实蝇求偶交配行为中的功能提供参考,并为深入研究桔小实蝇的求偶交配行为和绿色防控提供了理论基础。

摘要: 【目的】探明危害我国柑橘的实蝇种类以及柑橘大实蝇Bactrocera minax不同地理种群和不同寄主种群的遗传多样性。【方法】利用mtDNA COI基因对危害柑橘的果实蝇进行种类鉴定,采用MEGA软件对其中28个地理种群的535头果实蝇COI基因片段(约505 bp)序列进行比对,分析种间及种内遗传距离,构建系统发育树。使用DnaSP软件分析柑橘大实蝇不同地理种群和不同寄主种群的遗传多样性。【结果】从柑橘虫果内共鉴定出4种实蝇,分别为柑橘大实蝇B.minax、桔小实蝇B.dorsalis、蜜柑大实蝇B.tsuneonis和瑞丽果实蝇B.ruiliensis。这4种实蝇的种间遗传距离为0.02640.2410,种内遗传距离为0.00000.0140,种间与种内遗传距离没有重叠区域。单个柑橘虫果内一般仅有1种实蝇,极个别柑橘果实可同时被两种实蝇危害(4/43);在这些为害柑橘的实蝇种类中,以柑橘大实蝇的个体数量比例最大,占90.70%。柑橘大实蝇地理种群遗传多样性高,28个种群共有17个单倍型。【结论】柑橘大实蝇是所调查地区柑橘实蝇的绝对优势种,其种群遗传分化程度较高,扩散危害风险大。本研究结果对柑橘果实蝇类的监测和防控具有重要意义。

摘要: 【目的】克隆南亚实蝇Zeugodacus tau鞣化激素基因,分析其分子特征及时空表达模式,为探索其生理功能奠定基础。【方法】利用同源克隆和RACE技术从南亚实蝇刚羽化成虫中克隆鞣化激素基因bursicon-α和bursicon-β的全长cDNA序列,并用邻接法(neighbor-joining method)与其他昆虫同源序列构建系统发育进化树。利用荧光定量PCR技术检测这两个基因在南亚实蝇不同发育阶段(卵、1-3龄幼虫、预蛹、蛹和刚羽化成虫)的表达特性。【结果】克隆获得南亚实蝇鞣化激素基因bursicon-α(GenBank登录号:MH421861)和bursicon-β(GenBank登录号:MH421862)。bursicon-α基因开放阅读框为551 bp,编码183个氨基酸;bursicon-β基因开放阅读框为467 bp,编码156个氨基酸。基于两个鞣化激素基因的氨基酸序列的系统发育树分析显示,南亚实蝇Bursicon-α与Bursicon-β均与瓜实蝇Zeugodacus cucurbitae的同源蛋白亲缘关系最近,且与其他双翅目昆虫的同源蛋白聚为一类,形成独立的分支。荧光定量PCR结果表明,两个基因在南亚实蝇各龄期均有表达,均在第5天蛹和刚羽化成虫翅伸展时期表达量最高。【结论】bursicon-α和bursicon-β基因在南亚实蝇不同发育阶段表达量不同,推测其在南亚实蝇成虫表皮鞣化和翅的形成中发挥着重要作用。本研究为进一步探索鞣化激素在南亚实蝇生长过程中表皮的骨化、翅的重建等方面的功能机制奠定了基础。

摘要: 【目的】通过比较柑橘大实蝇Bactrocera minax蛹滞育期与滞育前和滞育后以及滞育蛹与非滞育蛹体内海藻糖和葡萄糖含量的变化、海藻糖合成代谢途径中关键酶的活力变化以及关键酶基因的表达量变化,明确蛹滞育期间海藻糖合成代谢途径中关键酶对海藻糖含量的调控。【方法】利用分光光度法检测柑橘大实蝇滞育前(1日龄蛹)、滞育期(30,60和90日龄蛹)以及滞育后(120和150日龄蛹)蛹体内海藻糖与葡萄糖含量的变化,以及海藻糖合成代谢途径中的海藻糖-6-磷酸合成酶(TPS)、海藻糖-6-磷酸磷酸酯酶(TPP)和海藻糖酶(Tre)活力的变化;利用实时定量荧光PCR(qPCR)检测TPS,TPPB,TPPC-1,TPPC-2和Tre-1基因表达量的变化。向1日龄蛹体内注射20-羟基蜕皮酮(20E)作为处理(以注射10%乙醇为对照),分别于注射后1和30 d比较处理组与对照组蛹体内海藻糖与葡萄糖含量、关键酶活力以及上述基因表达量的差异。【结果】柑橘大实蝇蛹进入滞育后,海藻糖含量显著升高,葡萄糖含量无显著变化; TPS和TPP的酶活力以及TPS,TPPC-1和TPPC-2表达量在化蛹后逐渐升高,于滞育期达到最高水平,维持至羽化前显著下降;TPPB表达量在整个蛹期无显著差异; Tre酶活力以及Tre-1表达量在化蛹后逐渐升高,于滞育早期达到最高水平,随后显著下降,羽化前再次显著上升。注射20E后1 d,与对照组相比,处理组蛹体内海藻糖与葡萄糖含量、关键酶(TPS,TPP和Tre)活力以及TPS,TPPC-2和Tre-1表达量无显著变化,TPPB表达量显著下降,TPPC-1表达量显著上升;注射后30 d,与对照组滞育蛹相比,处理组非滞育蛹海藻糖含量显著上升,葡萄糖含量、TPS和Tre酶活力、TPS和Tre-1表达量显著下降,TPP酶活力以及TPPB和TPPC-2表达量无显著差异。【结论】柑橘大实蝇蛹体内海藻糖的含量在合成代谢途径中关键酶的调控下,随着滞育状态发生变化,表明海藻糖与滞育之间存在密切的关系,但其作用机理仍待进一步研究。

摘要: 【目的】昆虫的气味结合蛋白(odorant binding proteins,OBPs)与嗅觉识别密切相关,在触角感受器淋巴液内运输外界的脂溶性气味分子顺利到达嗅觉受体过程中起着关键的作用。本研究对柑橘大实蝇Bactrocera minax的气味结合蛋白基因进行了克隆和表达分析,旨在更好地了解气味结合蛋白在柑橘大实蝇嗅觉识别中的作用及为进一步研究柑橘大实蝇嗅觉传递的分子机制奠定基础。【方法】利用RT-PCR和RACE技术克隆柑橘大实蝇的气味结合蛋白基因,并进行生物信息学分析;构建重组表达载体p ET28a(+)-Bmin OBP25,转化到大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中,SDS-PAGE及Western blotting鉴定重组表达蛋白;采用荧光定量PCR检测该基因在柑橘大实蝇成虫不同组织中的表达。【结果】克隆获得柑橘大实蝇气味结合蛋白基因的c DNA全长序列,命名为Bmin OBP25(Gen Bank登录号:MH181875)。测序结果表明,Bmin OBP25开放阅读框全长447 bp,编码148个氨基酸,预测分子量为17.5 k D,编码序列具有OBPs典型的6个保守半胱氨酸和6个α螺旋区域特征。在IPTG诱导下目标蛋白以6×His标签融合蛋白的形式在宿主菌中得到稳定表达。荧光定量PCR分析表明,Bmin OBP25 mRNA在成虫触角、头(去除触角)、胸、腹、足、翅和产卵器中均有表达,其中在触角、头(去除触角)、足和产卵器中表达量较高。【结论】Bmin OBP25在柑橘大实蝇成虫触角、头、足和产卵器中具有高转录活性,提示该基因在非嗅觉组织中可能也具有生理功能,特别是可能在昆虫的取食与产卵地选择过程中起重要作用,其功能还需深入研究。本研究实现了Bmin OBP25基因的原核表达,为深入研究Bmin OBP25基因的功能奠定基础。