摘要: [目的]柞蚕微孢子虫Nosema pernyi引发柞蚕Antheraea pernyi微粒子病,威胁柞蚕种质资源的保育及生产安全,并且能够经卵垂直传播,因此需要寻找柞蚕体内应对柞蚕微孢子虫侵染后的免疫基因,为后续寻找和培育抗微粒子病新品种提供帮助。[方法]构建柞蚕微孢子虫侵染后柞蚕卵转录组,进行GO和KEGG分析确定免疫相关基因;PCR克隆柞蚕谷胱甘肽S-转移酶(glutathione Stransferases,GST)基因ApGSTo1并进行生物信息学分析;运用RT-qPCR检测ApGSTo1在柞蚕微孢子虫侵染后柞蚕产卵后0-10 d卵中的表达量。[结果]在感染与未感染柞蚕微孢子虫柞蚕卵转录组检测到的表达基因数为17 453,其中显著差异表达基因数目为89个,GO分类中细胞解剖实体和催化活性的基因数量最多,KEGG分析中参与运输和分解代谢、信号转导和消化系统这3个通路的基因数量最多。基于柞蚕微孢子虫侵染后柞蚕卵转录组数据分析,将ApGSTo1作为目的基因,PCR克隆及系统进化分析结果证明ApGSTo1属于GST的Omega家族;感染柞蚕微孢子虫柞蚕卵中ApGSTo1表达量比正常对照组的高,且在产卵后2 d时的表达量极显著高于正常对照组的。[结论]获得了柞蚕微孢子虫侵染后柞蚕卵转录组数据,找到了1个免疫相关基因ApGSTo1,从分子生物学和转录水平初步证明了ApGSTo1参与柞蚕卵内的抗柞蚕微孢子虫侵染,还发现了抗柞蚕微孢子虫侵染反应的关键时间为产卵后2 d时,为后续研究ApGSTo1在抗逆性和氧化还原等功能方面提供研究基础。

摘要: 【目的】东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae作为蜜蜂微孢子虫病的主要病原体，对其侵染机制的相关研究鲜有报道。本研究旨在对团队前期通过质谱鉴定获得的东方蜜蜂微孢子虫候选孢壁蛋白NcER＿100148进行原核表达，明确其亚细胞定位，并初步探索其生物学功能。【方法】通过在线软件对前期鉴定的东方蜜蜂微孢子虫候选孢壁蛋白NcER＿100148序列进行生物信息学分析；利用RT-PCR检测东方蜜蜂微孢子虫侵染后西方蜜蜂Apis mellifera成蜂中肠中NcER＿100148的表达量；将NcER＿100148基因片段克隆至原核表达载体pET30a中，IPTG诱导表达重组蛋白并用于制备多克隆抗体；利用Western blot检测NcER＿100148在东方蜜蜂微孢子虫成熟孢子中的表达量；通过间接免疫荧光和免疫电镜技术分析NcER＿100148在东方蜜蜂微孢子虫成熟孢子中的亚细胞定位；利用Western blot和免疫共沉淀法分别分析重组蛋白NcER＿100148与东方蜜蜂微孢子虫几丁质孢子壳(chitin spore coats, CSCs)和极管蛋白NcPTP2和NcPTP3的相互作用关系。【结果】序列分析结果表明，东方蜜蜂微孢子虫NcER＿100148预测分子量为12.169 kD,含1个O-糖基化位点、1个N-糖基化位点和1个糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol, GPI)锚定位点；RT-PCR检测结果表明，NcER＿100148在东方蜜蜂微孢子虫感染后4 d时的西方蜜蜂成蜂中肠中开始表达；Western blot结果表明，NcER＿100148蛋白能在成熟孢子表面表达，并且能够与东方蜜蜂微孢子虫的CSCs互作；亚细胞定位结果显示NcER＿100148定位于东方蜜蜂微孢子虫的成熟孢子孢壁上；Western blot和免疫共沉淀结果显示重组蛋白NcER＿100148能够与极管蛋白NcPTP2和NcPTP3相互作用。【结论】NcER＿100148是定位在东方蜜蜂微孢子虫的成熟孢子孢壁上的一个新型孢壁蛋白，且其可能在孢子内壁的构建、极管的盘绕与固定和参与对宿主的侵染等过程中扮演重要的角色。

摘要: 【目的】本研究旨在为探究nce-miR-10660调控东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae侵染的作用机制提供理论和实验依据。【方法】采用Stem-loop RT-PCR对前期鉴定到的东方蜜蜂微孢子虫nce-miR-10660进行表达验证，再通过Sanger测序验证nce-miR-10660的序列。利用相关生物信息学软件预测和分析nce-miR-10660的靶基因。通过RT-qPCR检测nce-miR-10660及其靶基因在东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica工蜂过程中中肠中的表达谱。【结果】Stem-loop RT-PCR和Sanger测序结果分别证实了nce-miR-10660在东方蜜蜂微孢子虫孢子中的表达和真实存在。靶向预测结果显示nce-miR-10660共靶向RRDRP和RCDP 42等9个基因；分别有2和6个靶基因可被分别注释到KEGG数据库中的4条通路和GO数据库中的23个条目。RT-qPCR结果显示，相较于东方蜜蜂微孢子虫侵染后1 d时意大利蜜蜂工蜂中肠中nce-miR-10660的表达量，东方蜜蜂微孢子虫侵染后2 d时意大利蜜蜂工蜂中肠中nce-miR-10660的表达量显著上调，在东方蜜蜂微孢子虫侵染后4, 6和8 d时意大利蜜蜂工蜂中肠中nce-miR-10660的表达量均显著下调；东方蜜蜂微孢子虫侵染后4, 6和8 d时意大利蜜蜂工蜂中肠中靶基因RRDRP的表达量均显著下调表达；东方蜜蜂微孢子虫侵染后2, 4, 6和8 d时意大利蜜蜂工蜂中肠中靶基因RCDP 42的表达量显著下调。【结论】nce-miR-10660在东方蜜蜂微孢子虫孢子中真实存在和表达；nce-miR-10660及其靶向的RRDRP和RCDP 42在东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂工蜂过程中差异表达；nce-miR-10660通过正调控RRDRP和RCDP 42表达潜在参与调节东方蜜蜂微孢子虫侵染。

摘要: 【目的】丰富东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae的微小RNA(microRNA, miRNA)信息，并为深入探究miRNA在病原孢子和病原侵染中的功能提供理论和实验依据。【方法】基于已获得的small RNA-seq数据，利用生物信息学软件对东方蜜蜂微孢子虫的纯净孢子中的miRNA进行鉴定和分析。采用茎环反转录PCR(stem-loop RT-PCR)检测已鉴定的miRNA的表达；通过分子克隆与Sanger测序验证miRNA的序列。使用TargetFinder软件预测这些miRNA的靶基因，并对靶基因进行数据库注释。根据miRNA与靶基因的靶向结合关系构建调控网络，再利用Cytoscape软件进行可视化。【结果】在东方蜜蜂微孢子虫孢子中共鉴定到10个miRNA;这些miRNA的长度分布介于2125 nt,首位碱基表现出U偏向性，每一位碱基的偏向性差异明显。Stem-loop RT-PCR检测结果表明这10个miRNA均真实表达；Sanger测序结果证实了随机选取的其中2个miRNA的序列真实性。共预测出249个靶基因，其中分别有249, 118, 136和3个靶基因可注释到Nr, Swiss-Prot, KOG和eggNOG数据库。此外，分别有134和71个靶基因可分别注释到GO数据库的30个功能条目和KEGG数据库的54条通路。【结论】本研究揭示了东方蜜蜂微孢子虫孢子中miRNA的存在和表达；这些miRNA通过调控潜在靶基因的表达参与孢子的生命活动。

摘要: 【目的】微孢子虫(Microsporidia)孢壁在孢子构成及孢子侵染宿主过程中扮演重要的角色。本研究旨在鉴定获得的东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae新型孢壁蛋白,并进行基因克隆和原核表达,明确其亚细胞定位。【方法】通过在线软件对东方蜜蜂微孢子虫新型孢壁蛋白AAJ76_1400036761序列进行生物信息学分析。利用PCR法获取目的片段并将其克隆至原核表达载体pCold II中,利用IPTG诱导表达重组蛋白并通过镍柱亲和层析法纯化目的蛋白。以获得的重组蛋白为抗原免疫小鼠制备多克隆抗体,通过间接免疫荧光技术和免疫胶体金定位技术对该蛋白进行亚细胞定位分析;利用蛋白质免疫印迹法检测该蛋白与东方蜜蜂微孢子虫几丁质壳的互作。【结果】在MicrosporidiaDB数据库中获得AAJ76_1400036761基因序列,基因全长681 bp,编码226个氨基酸;预测等电点为6.84,分子量为26.19 kD。SDS-PAGE电泳和Western blot结果表明AAJ76__1400036761重组蛋白能够在大肠杆菌Eescherichia coli Rosetta中高量表达。Western blot结果表明,制备的多克隆抗体能够特异地识别东方蜜蜂微孢子虫总蛋白中的AAJ76__1400036761,说明其在成熟东方蜜蜂微孢子虫中有表达。亚细胞定位结果显示,AAJ76__1400036761定位于东方蜜蜂微孢子虫孢壁上。重组蛋白AAJ76_1400036761能够与蜜蜂微孢子虫的几丁质壳结合。【结论】AAJ76_1400036761蛋白在东方蜜蜂微孢子虫成熟孢子中有表达;该蛋白定位于东方蜜蜂微孢子虫孢壁上,为东方蜜蜂微孢子虫新的孢壁蛋白。本研究为深入研究该蛋白的生物学功能奠定了基础。