摘要: 目的 本研究以微小隐孢子虫含有纤维连接蛋白Ⅲ型结构域蛋白（Cryptosporidium parvum fibronectin typeⅢdomain-containing protein, CpFN3）为研究对象，研究其亚细胞定位和黏附特性。方法 该蛋白由cgd4＿640基因编码、全长为含有2 430个氨基酸的I型跨膜蛋白。设计特异性抗原多肽并免疫家兔，获得多克隆抗体，利用亲和纯化法获特异性抗体；经Western blot方法验证该抗体特异性，再通过间接免疫荧光法（IFA）进行蛋白定位。通过原核表达获得重组蛋白（His-CpFN3）,通过ELISA确定重组蛋白与HCT-8细胞和肝素的结合情况。结果 成功获得纯化的抗CpFN3抗体，Western blot分析显示该抗体可识别条带大小约为280 kDa; IFA结果表明该蛋白定位于子孢子的表膜，呈点状分布。该蛋白在子孢子入侵阶段及胞内无性繁殖和有性繁殖阶段均有表达。利用重组蛋白，确定了CpFN3能够与HCT-8细胞及肝素结合（结合常数K_d分别为0.23和1.21μmol/L）,并呈剂量依赖性和可饱和性。结论 本研究确定CpFN3参与了虫体与宿主细胞的黏附过程。

摘要: 本研究旨在解析东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae的腺苷酸激酶（Adenylat kinase, ADK）NcADK的理化性质和分子特性，并检测NcADK基因在东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica工蜂过程中的表达特征，以期丰富NcADK相关信息，并为进一步的功能研究提供依据。利用相关生物信息学软件预测和分析NcADK的理化性质、信号肽、磷酸化位点、二级结构和三级结构。使用MEME软件和Batch CD-Search工具分别预测东方蜜蜂微孢子虫和其它7种微孢子ADK蛋白的保守基序和保守结构域。通过Mega 11.0软件基于ADK氨基酸序列构建进化树。采用RT-qPCR检测东方蜜蜂微孢子虫侵染过程中NcADK的相对表达量。结果表明，NcADK的CDS含有540个核苷酸，可编码179个氨基酸；NcADK的分子量约为20.66 kDa,分子式为C₉₀₃H₁₄₈₈N₂₅₈O₂₇₈S₈,脂肪系数为100.61,平均亲水系数为-0.502,等电点为6.83,含29个负电荷氨基酸和29个正电荷氨基酸；NcADK可同时定位于细胞质、线粒体、细胞核、囊泡和过氧化物酶体；NcADK含20个磷酸化位点，不含典型的信号肽；NcADK含88个α-螺旋，24条延长链，17个β-转角，50个无规则卷曲，与模板A0A0F9WEU7.1.A之间的序列同源性为100%;在东方蜜蜂微孢子虫、东方赤孢子虫Hamiltosporidium tvaerminnensis、肠脑炎微孢子虫Encephalitozoon intestinalis、按蚊微孢子虫Anncaliia algerae和角膜条孢虫Vittaforma corneae ADK中均鉴定到1个相同的结构域和5个相同的保守基序；东方蜜蜂微孢子虫与蜜蜂微孢子虫Nosema apis的ADK在进化树上聚为一支。相较于接种后1 d（1 day post inoculation, 1 dpi）,NcADK的表达量在2 dpi上调但无显著差异（P>0.05）,在3 dpi和4 dpi均显著上调（P>0.05）。研究结果明确了NcADK的理化性质和分子特性，并揭示NcADK是潜在的亲水性蛋白和胞内蛋白，不同微孢子虫的ADK具有较强的保守性，东方蜜蜂微孢子虫及其姐妹种蜜蜂微孢子虫的ADK具有高同源性，NcADK在3 dpi和4 dpi被激活表达。

摘要: 【目的】本研究旨在系统鉴定和分析西方蜜蜂Apis mellifera肽聚糖识别蛋白（peptidoglycan recognition protein, PGRP）相关基因及其剪接异构体，探析PGRP基因剪接异构体编码蛋白的理化性质和分子特征，并测定PGRP基因剪接异构体在西方蜜蜂工蜂成虫应答东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae侵染中的表达模式，以期为西方蜜蜂PGRP基因剪接异构体的功能研究提供参考和依据。【方法】基于已获得的西方蜜蜂8和11日龄工蜂成虫中肠纳米孔测序数据，利用Blast工具将前期鉴定到的所有全长转录本分别比对到Nr和KEGG数据库，筛选出西方蜜蜂PGRP基因及其剪接异构体，并随机选择PGRP基因的5条剪接异构体通过RT-PCR验证序列的真实性。使用Gffcompare软件将鉴定到的PGRP基因序列比对至西方蜜蜂参考基因组以优化基因结构。采用Astalavista软件鉴定PGRP基因的可变剪接（alternative splicing, AS）事件类型，再通过RT-PCR和Sanger测序验证AS事件。利用相关软件预测和分析PGRP基因剪接异构体编码蛋白的理化性质和分子特征。采用RT-qPCR检测东方蜜蜂微孢子虫接种后西方蜜蜂工蜂成虫中肠中PGRP基因剪接异构体的相对表达量。【结果】共鉴定到西方蜜蜂的4个PGRP相关基因（PGRP-3,PGRP-S2,PGRP-LC和PGRP-LB）及其19条剪接异构体。通过RT-PCR与Sanger测序证实了PGRP基因5条剪接异构体（rna14029, ONT.6350.8, ONT.6350.10, rna24089和ONT.6350.7）的表达和序列真实性。PGRP-3（gene10434）的5′和3′端分别延长了8和1 055 bp,PGRP-S2（gene10435）的5′和3′端分别延长了27和234 bp。通过RT-PCR证实了PGRP-S2的AS事件的真实性。剪接异构体ONT.6350.2编码蛋白的分子式为C₉₆₆H₁₅₀₂N₂₇₂O₂₇₅S₇,分子量约为21 527.63 D,理论等电点为8.94,平均亲水性为-0.119,含有信号肽和PGRP结构域，不含跨膜结构域；剪接异构体ONT.6350.6编码蛋白分子式为C₈₄₁H₁₃₀₁N₂₄₃O₂₄₄S₅,分子量约为18 860.46 D,理论等电点9.14,平均亲水性为-0.324,不含跨膜结构域和信号肽。西方蜜蜂与东方蜜蜂A.cerana的PGRP-S2在进化树上聚为一支。相较于未接种东方蜜蜂微孢子虫的对照组，接种东方蜜蜂微孢子虫的西方蜜蜂工蜂成虫中肠中剪接异构体ONT.6350.2的表达量在接种后2和4 d时显著上调，在接种后3 d时极显著上调；剪接异构体ONT.6350.6与ONT.6350.2的表达模式相同；剪接异构体ONT.6350.2和ONT.6350.6在接种东方蜜蜂微孢子虫后1-4 d时总体上均表现为上升表达趋势。【结论】本研究优化了西方蜜蜂参考基因组上已注释的PGRP-3和PGRP-S2基因结构；揭示剪接异构体ONT.6350.2的编码蛋白可能是分泌蛋白，而剪接异构体ONT.6350.6的编码蛋白可能是胞内蛋白；西方蜜蜂与东方蜜蜂的PGRP-S2同源性最高；剪接异构体ONT.6350.2和ONT.6350.6在西方蜜蜂工蜂成虫应答东方蜜蜂微孢子虫侵染中被激活表达。

摘要: 【目的】本研究旨在克隆东方蜜蜂Apis cerana基质金属蛋白酶14（matrix metalloproteinase-14, MMP14）基因AcMMP14,分析其分子特征和表达模式，为持续深入开展AcMMP14的功能研究提供参考和依据。【方法】提取东方蜜蜂6日龄工蜂幼虫肠道总RNA,PCR扩增AcMMP14的编码序列（coding sequence, CDS）。使用相关生物信息学软件预测AcMMP14的理化性质和分子特征，鉴定东方蜜蜂和其他蜂种MMP14的结构域和保守基序，并进行系统进化分析。采用RT-qPCR检测AcMMP14在工蜂卵、幼虫、预蛹、蛹和不同日龄成虫，工蜂成虫触角、脑、表皮、脂肪体、毒腺、中肠和咽下腺及东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae接种刚出房的1日龄工蜂后1-4 d时中肠中的相对表达量。【结果】AcMMP14的分子式为C₃₀₆₈H₄₅₈₁N₈₀₃O₉₁₅S₂₀,分子量约为68.00 kD,脂溶系数为64.12,等电点为5.85,平均亲水系数为-0.47,含1个信号肽和36个磷酸化位点，可同时定位于线粒体、细胞核和细胞质。东方蜜蜂与其他10种蜂的MMP14中均含有3个相同的结构域和5个相同的保守基序。东方蜜蜂与大蜜蜂A.dorsata的MMP14的氨基酸序列一致性达94.23%,且在进化树上聚为一支。AcMMP14在东方蜜蜂工蜂卵、3日龄幼虫、 1和2日龄预蛹及4日龄蛹中差异表达，在4日龄蛹中的表达量最高且显著高于3日龄幼虫和2日龄预蛹中的表达量。AcMMP14在不同日龄工蜂成虫体内差异表达，在15日龄成虫体内的表达量最高且显著高于1, 2, 6, 12和17日龄成虫体内的表达量。AcMMP14在东方蜜蜂工蜂成虫的7种不同组织中差异表达，在触角中的表达量最高且显著高于脑、表皮、脂肪体、毒腺、中肠和咽下腺中的表达量。与未接种的对照组相比，东方蜜蜂微孢子虫接种后1和2 d时工蜂成虫中肠中AcMMP14的表达量显著下调，3和4 d时工蜂成虫中肠中AcMMP14的表达量下调但差异不显著。【结论】AcMMP14为潜在的亲水性蛋白和分泌蛋白；AcMMP14在东方蜜蜂工蜂不同发育阶段和成虫组织中发挥潜在的重要功能；工蜂成虫中肠中AcMMP14在东方蜜蜂微孢子虫的第一个增殖周期前期被激活表达。

摘要: 目的 建立一种快速、敏感、特异、可同时检测隐孢子虫、球虫和牛细小病毒的多重PCR检测方法。方法 针对隐孢子虫SSU rRNA基因、球虫SSU rRNA基因、牛细小病毒VP2基因分别设计特异性引物并构建重组质粒标准品。经温度梯度PCR法和单一控制变量法优化反应条件，建立多重PCR检测方法并对其敏感性、特异性、重复性和临床应用进行评价。结果 多重PCR方法的最佳退火温度为60.5℃,球虫上下游引物各为0.2μmol/L、隐孢子虫和牛细小病毒上下游引物各为0.4μmol/L;建立的方法敏感性高，对隐孢子虫、球虫和牛细小病毒的重组质粒标准品的最低检测下限分别为243、260和3 110 copies;特异性强，与牛群常见沙门氏菌、病毒性腹泻病毒、轮状病毒等10种病原无交叉反应。重复性好，批内与批间实验结果均一致。利用建立的多重PCR方法对从四川甘孜州部分地区送检的81份临床腹泻样品进行检测，结果隐孢子虫、球虫和牛细小病毒的阳性率分别为18.52%(15/81)、34.57%(28/81)、18.52%(15/81),三者混合感染阳性率为3.7%(3/81)。结论 建立的隐孢子虫、球虫和牛细小病毒多重PCR方法，可为临床3种常见牦牛腹泻病原的鉴别诊断及流行病学调查提供技术支持。