摘要: 为探讨PCR技术对实验感染大、小鼠肺孢子虫肺炎(PCP)和临床疑似病例诊断的可行性。用皮下注射地塞米松法诱导SD大鼠和ICR小鼠PCP并收集临床疑似病例24h深部痰液。受试动物解剖后,制备肺印片,经瑞姬氏复合染色镜检确定肺孢子虫(Pc)感染的阳性率;同时,以针对虫体mtLSUrRNA基因设计的引物,PCR扩增鼠肺组织和支气管灌洗液(BALF),以及痰液样本中的DNA;比较实验动物样本镜检和PCR两种方法的检测结果;测定PCR的敏感性和特异性。结果表明,SD大鼠和ICR小鼠肺印片的阳性率分别为68.8%(1116)和85.7%(1821),肺组织PCR检测的阳性率分别为75%(1216)和80.9%(1721),肺泡灌洗液PCR的阳性率分别为81.2%(1316)和23.8%(521)。肺印片镜检和PCR技术检测结果无显著性差别;可见,PCR对虫体mtLSUrRNA基因的检测具有显著的特异性和敏感性,至少可以检测出0.6pg的肺孢子虫DNA;6例临床疑似病例样本中2例显示肺孢子虫PCR阳性反应。

摘要: 将微小隐孢子虫Cpgp4015基因定向克隆到真核表达载体pVAX1中多克隆位点XbaⅠ和PstⅠ之间,经酶切鉴定,构建真核表达重组质粒pVAX1-Cpgp4015,用脂质体介导法将其转染Hela细胞,并用G418加压筛选,后经SDSPAGE和Westernblot方法检测外源基因Cpgp4015的表达情况,得到预期大小的蛋白带,表明该重组质粒能够在哺乳动物细胞中较好地表达。

摘要: 通过流行病学调查分离到奶牛隐孢子虫虫株,经实验室鉴定为牛安氏隐孢子虫(Cryptosporidiumandersoni),经蔗糖漂浮法收集和蔗糖密度梯度离心、滤器滤过、多次低速离心提纯后,通过冻融和超声波处理的全卵囊抗原免疫Balb/c小鼠4次,取阳性小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合。经间接ELISA方法筛选,有限稀释法3～4次克隆,获得5株分泌抗牛安氏隐孢子虫(C.andersoni)单克隆抗体的杂交瘤细胞株(1A3,3B10,3F4,4B3,4F11)。5株单抗的染色体数目平均在96～98条之间,上清效价分别在1∶100和1∶12800之间,腹水效价分别在1∶12800和1∶204800之间。采用免疫荧光法对各株的单抗腹水进行初步鉴定,发现其中4株为抗卵囊壁单抗,1株为抗子孢子单抗。对其中3株单抗的腹水提纯后进行SDS-PAGE电泳分析,其重链分子量约为52·7kDa,轻链分子量约为24kDa。

摘要: 用PCR方法扩增抗隐孢子虫子孢子ScFv片段,插入表达载体pET-28a中,构建重组质粒pET-28-ScFv,然后,将绿脓杆菌外毒素(PE40)片段定向克隆到ScFv基因的下游,构建免疫毒素表达质粒pET28ScFv-PE40。经酶切分析、PCR检测和测序进行鉴定。成功地构建了免疫毒素表达质粒pET28ScFv-PE40。将上述质粒转化受体菌BL21(DE3)后,经IPTG诱导,成功地表达了目的蛋白。免疫毒素ScFv-PE40大小约为66kDa,表达量约占菌体蛋白总量的14%。

摘要: 应用RT PCR技术 ,从分泌抗隐孢子虫表膜单克隆抗体 (McAb)的杂交瘤细胞 4G4中 ,扩增出抗体VH 和VL 基因 ,用Linker (Gly4 Ser) 3基因 ,将VH 和VL 基因连接成ScFv基因 ,并将其克隆至pMD 18T载体中。经核甘酸序列分析证实 ,VH 和VL 基因及Linker基因拼接正确 ,基因全长 717bp ,经计算机分析 ,VH和VL 基因均为新发现的基因序列 ,符合功能性重排的鼠抗体可变区基因特征