摘要: 【目的】本研究旨在克隆并鉴定松墨天牛Monochamus alternatus内源漆酶基因MaLac1,分析其在松墨天牛不同发育阶段的表达水平,为进一步明确MaLac1功能提供依据。【方法】基于松墨天牛肠道转录组测序数据,通过RACE克隆松墨天牛MaLac1基因的全长cDNA序列,并对其进行生物信息学分析;将该基因与pET-32a载体链接构建表达载体pET-MaLac1,导入大肠杆菌Escherichia coli Rosetta (DE3)使其表达;使用qPCR检测MaLac1基因在松墨天牛不同发育阶段(低龄幼虫、老熟幼虫、蛹、雌成虫和雄成虫)肠道中的表达差异。【结果】克隆获得松墨天牛MaLac1的cDNA全长序列(GenBank登录号:KY073340)。MaLac1开放阅读框全长2 067 bp,编码一个含688个氨基酸的蛋白质,预测分子量为78.34 kD,等电点为5.30。SignalP 4.1 Server预测MaLac1在N端包含一个15个氨基酸的信号肽。序列比对分析表明,MaLac1具有典型的昆虫漆酶基因特征,与赤拟谷盗Tribolium castaneum漆酶基因的氨基酸序列一致性达93%。SDS-PAGE检测发现IPTG诱导表达了一条大约78 kD的特异蛋白条带,与推测大小一致。qPCR结果显示,MaLac1在不同发育阶段的松墨天牛肠道中均有表达,其中,在雌成虫肠道中表达量最高,在雄成虫肠道中的次之,在幼虫肠道中的最低。【结论】MaLac1在松墨天牛成虫中表达量显著高于其在幼虫中的,这一结果可能与幼虫和成虫的取食习性差异相关。MaLac1在松墨天牛体内的功能还有待进一步研究。

摘要: 【目的】硬皮肿腿蜂Sclerodermus spp.在寄生蜂中独有雌蜂合作繁育的准社会行为。本研究旨在明确该合作繁育行为在非自然寄主天牛上有何表现。【方法】随机选取松褐天牛Monochamus alternatus幼虫(体重范围0.160.44 g),个体称体重后分别接1, 2和4头已交配但尚未产卵的川硬皮肿腿蜂S.sichuanensis雌蜂即母蜂,观测母蜂产卵前期和子代发育表现等参数,分析寄主体重(连续自变量)和接蜂数(分类自变量)对这些参数的影响。【结果】对所有观测参数的分析未发现寄主体重与接蜂数这两因素之间存在互作影响,说明这两个因素独立影响观测特征。川硬皮肿腿蜂母蜂产卵前期随寄主体重增大而逐渐延长,但在母蜂数较多的情况下产卵前期缩短:接4头蜂处理下产卵前期比接1和2头处理下的产卵前期分别缩短18.3%和20.6%。按照母蜂平均产子代蜂数量(蜂均产蜂量)计算,接1头蜂处理下的蜂均产蜂量分别是接2和4头蜂处理下的蜂均产蜂量的1.5和3.3倍;蜂均产蜂量不受寄主体重的影响。子代蜂性比(雄蜂占比)在接蜂数较多处理下略有增大,但仍然极端偏雌;性比不受寄主体重的影响。子代卵至成虫存活率在接4头母蜂处理下最低,比接1和2头母蜂处理下分别降低37.4%和30.5%;子代卵至成虫存活率不受寄主体重的影响。子代蜂体型(后足胫节长度)随寄主体重增大而增大,但不受接蜂数的影响。【结论】本研究结果说明,在合作利用体型较大的非自然寄主时,母蜂数量比寄主体型大小对川硬皮肿腿蜂的合作繁育行为产生更大的影响。

摘要: 【目的】本研究旨在建立携带与未携带松材线虫Bursaphelenchus xylophilus的松墨天牛Monochamus alternatus成虫各组织的转录组数据库,揭示松墨天牛对松材线虫响应的转录组整体表达特征。【方法】以携带和未携带松材线虫的松墨天牛成虫的表皮、气管和脂肪体为材料,采用Illumina HiSeq(TM) 2000测序平台开展转录组测序,利用Trinity软件对RNA-Seq数据进行从头组装,利用NCBI数据库进行基因注释。通过DEG-Seq分析携带和未携带松材线虫的松墨天牛成虫中的差异表达基因,对上调表达基因进行GO和KEGG代谢途径富集分析,并通过实时荧光定量PCR技术对部分差异表达的基因包括ENV, CDK1, HSP70-C, HSP70, HSP75, DUO, PABPN1和IGFP基因的表达水平进行验证。【结果】测序过滤后共获得55 059条单基因簇(unigene),平均长度为1 536 bp。将unigene与数据库中的序列进行BLASTX比对,成功注释24 354条unigenes,其中4 022条unigene在GO数据库中获得注释,6 098条unigene在KEGG数据库中获得注释。经过GO与KEGG富集分析显示,松墨天牛成虫携带松材线虫后,差异表达基因主要为与其气管中压力调节、组织与DNA修复、激素响应方面相关的基因。实时荧光定量PCR分析结果显示CDK1, HSP70, HSP75, DUO, PABPN1和IGFP基因的表达量在携带松材线虫的松墨天牛气管中相比未携带松材线虫的松墨天牛气管中的显著上调。【结论】本研究初步阐明松墨天牛携带松材线虫后转录组的整体表达模式,为进一步研究松墨天牛的基因功能及对松材线虫的胁迫响应过程奠定了基础。

摘要: 【目的】松墨天牛Monochamus alternatus是我国南方松林中的重要蛀干害虫,也是林业检疫性病害——松材线虫病的主要媒介昆虫,其分布范围较广,对温度的适应性强,本研究旨在初步探讨松墨天牛对温度胁迫适应性的分子机制。【方法】采用RT-PCR与RACE技术克隆松墨天牛小热激蛋白(small heat shock protein,sHSP)基因的全长cDNA,结合生物信息学方法分析小热激蛋白的结构特征;利用qPCR技术测定该基因在松墨天牛不同发育阶段、4龄幼虫不同组织及不同低温和高温胁迫下4龄幼虫中的表达谱,并用geNorm,NormFinder和BestKeeper软件对不同温度下内参基因稳定性进行评价。【结果】获得松墨天牛sHSP基因的cDNA全长序列,命名为MaltHSP21.20(GenBank登录号:MH091811),全长为871 bp,编码187个氨基酸,信号肽预测表明其N末端含有18个氨基酸的信号肽,成熟蛋白预测分子质量为21.20 kD,等电点为8.65。结构域预测符合小热激蛋白家族的特征,共含有10个β折叠片,在α结构域内含有7个β折叠片。进化树分析表明该蛋白氨基酸序列与光肩星天牛Anoplophora glabripennis的sHSP有较高的同源性。不同软件分析得到最稳定的内参基因存在差异,结合3种方法评价得出RPL10最为稳定。MaltHSP21.20在不同发育阶段的松墨天牛体内均有表达,滞育幼虫中表达量最高,卵期及蛹期表达量次之;在4龄幼虫不同组织中均有分布,脂肪体中表达量最高;4龄幼虫MaltHSP21.20对低温诱导无响应,其表达量在35℃时显著上调,45℃处理2和3 h最高,50℃时下降。【结论】RPL10是不同温度胁迫下较稳定的内参基因。相比其他热激蛋白基因,MaltHSP21.20对低温敏感性较低,推测其在幼虫滞育越冬及抵抗高温中发挥重要作用。

摘要: 【目的】挖掘能影响桑天牛Apriona germari行为反应的山核桃Juglans mandshurica挥发物,为筛选桑天牛的植物源引诱剂或驱避剂提供理论依据。【方法】采用动态顶空套袋法收集不同危害状态[健康(CK)以及桑天牛取食、产卵和钻蛀危害]下山核桃释放的挥发物,并利用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)、气相色谱-触角电位测量系统(GC-EAD)及Y型嗅觉仪分析鉴定出桑天牛成虫对其产生电生理及行为反应的挥发物。【结果】不同危害状态下山核桃释放的挥发物皆以萜烯类和芳香族化合物居多,且有多种成分相对含量存在显著性差异,其中每种危害状态下山核桃释放的挥发物都有一种或几种特有的成分。桑天牛成虫仅对不同危害状态下山核桃释放的蒎烯、乙酸叶醇酯、壬醛、α-萜品醇、丙烯酸-2-乙基己酯及正十六烷6种挥发物产生显著的电生理反应,对其他挥发物无反应,其中雌成虫对壬醛的电生理反应最强,而雄成虫对乙酸叶醇酯的电生理反应最强。嗅觉反应结果显示,丙烯酸-2-乙基己酯仅对桑天牛雌成虫有显著的引诱作用(P<0.05),而乙酸叶醇酯则仅对雄成虫有极显著的引诱作用(P<0.01);壬醛对桑天牛雌雄成虫均有显著的引诱作用(P<0.05),而α-萜品醇则对其有显著的驱避作用(P<0.05)。【结论】本研究结果表明,乙酸叶醇酯、壬醛和丙烯酸-2-乙基己酯对桑天牛成虫有较强的引诱作用,而α-萜品醇则对其有较好的驱避作用。