摘要: 【目的】粉蚧是一类重要的世界性检疫性害虫,对果蔬产业以及水果的进出口贸易造成了巨大威胁。通常,口岸截获的粉蚧多为若虫或残体,加之隐存种的存在和较小的近缘种间差异,严重影响了基于形态学特征的粉蚧类害虫识别鉴定的准确性和及时性。本研究旨在明确DNA条形码技术对重大潜在入侵害虫大洋臀纹粉蚧Planococcus minor(Maskell)的鉴定有效性。【方法】以旅检截获的36头大洋臀纹粉蚧为对象、其近缘种柑橘臀纹粉蚧Pl.citri(Risso)为参照,以线粒体COI基因5'端和3'端序列以及核糖体28S r DNA D2-D3区段序列为分子标记进行比对分析,以K-2-P模型计算种内种间遗传距离,以最大似然法(maximum likelihood,ML)构建进化树并进行系统发育分析,同时利用Species Identifier物种识别软件评价3种基因片段对大洋臀纹粉蚧的鉴定效果。【结果】当分别以COI基因5'端和3'端序列为分子标记时,截获大洋臀纹粉蚧的碱基序列与NCBI中大洋臀纹粉蚧的序列一致性分别为100%和99%100%,而与近缘种柑橘臀纹粉蚧COI基因5'端和3'端的核苷酸序列一致性分别为97%98%和96%98%;且大洋臀纹粉蚧和柑橘臀纹粉蚧分别存在5个和11个稳定的物种特异性识别位点;系统发育分析显示,截获的大洋臀纹粉蚧均与数据库中的大洋臀纹粉蚧聚为一支。当以28S r DNA D2-D3区段序列为分子标记时,臀纹粉蚧属各物种间高度保守,无法区分大洋臀纹粉蚧与其近缘种柑橘臀纹粉蚧;种间遗传距离仅为0.004。此外,物种识别软件评价结果显示,基于COI基因5'端和3'端序列的鉴定结果完全正确,而基于28S r DNA D2-D3区段序列的鉴定结果却存在45.2%61.9%的模糊鉴定。【结论】基于COI基因5'端和3'端的DNA条形码技术完全可用于大洋臀纹粉蚧的快速准确鉴定及检测,对有效阻截其入侵和进一步扩散蔓延意义重大。

摘要: 大洋臀纹粉蚧Planococcus minor Maskell和南洋臀纹粉蚧P.lilacinus Cockerell是我国有重要检疫意义的有害生物。这两种粉蚧从东盟进口水果口岸检疫中频繁截获,且已在广东、海南、云南等地发现大洋臀纹粉蚧入侵,这对我国热带、亚热带的水果和观赏植物等已构成严重威胁。本研究以大洋臀纹粉蚧和南洋臀纹粉蚧在国内外的分布数据为基础,利用Maxent生态位模型和Arc GIS对两种粉蚧在中国的潜在适生区进行预测。预测结果表明,大洋臀纹粉蚧和南洋臀纹粉蚧的适生区主要分布在长江流域以南地区,其适生区面积分别占全国面积的22.14%、18.17%,其中高度适生区域集中分布在广西、广东、云南、福建、四川、台湾、海南等地区,与我国热带水果的主要种植区域具有高度的一致性。大洋臀纹粉蚧已成功入侵,一旦南洋臀纹粉蚧传入便可迅速扩散蔓延,并对我国热带水果生产造成严重危害。因此,各口岸应加强对东盟进口水果的检验检疫,预防其新的进入和扩散。

摘要: 【目的】应用微滴式数字PCR（droplet digital PCR,ddPCR）技术，建立大洋臀纹粉蚧Planococcus minor、南洋臀纹粉蚧Pl.lilacinus和木瓜秀粉蚧Paracoccus marginatus 3种高频截获检疫性粉蚧多重精准检测方法。【方法】以口岸截获和国内采集的常见粉蚧大洋臀纹粉蚧、南洋臀纹粉蚧、木瓜秀粉蚧、新菠萝灰粉蚧Dysmicoccus neobrevipes、杰克贝尔氏粉蚧Pseudococcus jackbeardsleyi、木槿曼粉蚧Maconellicoccus hirsutus、康氏粉蚧Ps.comstocki和桔臀纹粉蚧Pl.citri为参试材料，选择COⅠ基因序列为靶标，使用GenBank数据库、 MEGA11和Beacon Designer 8等进行同源性比对和特异性引物与探针设计；在构建的大洋臀纹粉蚧、南洋臀纹粉蚧和木瓜秀粉蚧3种粉蚧单重ddPCR检测体系的基础上，通过筛选最佳引物和探针浓度优化反应体系，建立可同时快速、绝对定量检测大洋臀纹粉蚧、南洋臀纹粉蚧和木瓜秀粉蚧基因组拷贝数的多重ddPCR检测方法，并与TaqMan qPCR方法进行比较，测定该方法的灵敏度、定量限及准确性。【结果】构建的多重ddPCR检测体系内各组引物和探针对目标粉蚧基因组均能扩增，未出现交叉反应，DNA最低检测浓度与TaqMan qPCR中的一致。这一多重ddPCR体系对大洋臀纹粉蚧基因组的绝对定量检测低限为0.44拷贝/μL,对南洋臀纹粉蚧基因组的绝对定量检测低限为0.43拷贝/μL,对木瓜秀粉蚧基因组的绝对定量检测低限为0.44拷贝/μL。在定量检测范围内这一多重ddPCR体系定量检测的线性决定系数R²均大于0.99,且重复性和线性相关性较好。【结论】本研究建立的多重ddPCR检测方法可实现对3种高频截获检疫性粉蚧大洋臀纹粉蚧、南洋臀纹粉蚧和木瓜秀粉蚧快速、精准鉴定，为口岸外来有害生物防控和保护我国生态安全提供技术服务和支持。