摘要: 【目的】探索异沙叶蝉Psammotettix alienus ATP6蛋白对小麦蓝矮植原体(wheat blue dwarf phytoplasma, WBDp)传播效率的影响。【方法】将异沙叶蝉mRNA反转录合成cDNA,构建分离泛素酵母双杂交膜系统cDNA文库;用WBDp的虫传相关蛋白P2-4为诱饵,从异沙叶蝉cDNA文库杂交筛选互作蛋白;通过RNAi沉默ATP6基因,验证ATP6蛋白对异沙叶蝉3龄若虫传播WBDp的影响。【结果】构建了异沙叶蝉分离泛素酵母双杂交膜系统cDNA文库,用P2-4从cDNA文库中杂交筛选获得了ATP6等多种互作蛋白。RNAi结果发现沉默ATP6基因后异沙叶蝉3龄若虫的WBDp传播率比对照组显著下降了23.33%±3.33%,表明ATP6是异沙叶蝉参与WBDp传播的关键蛋白。【结论】明确了异沙叶蝉ATP6是参与WBDp传播的一个关键蛋白。为进一步探明异沙叶蝉传播WBDp的分子机制和植原体病害的田间防治提供了理论基础。

摘要: 【目的】通过鉴定茶小绿叶蝉Empoasca flavescens成虫水状唾液蛋白中的细菌蛋白,解析叶蝉唾液的细菌种类。【方法】利用自制的收集装置和Parafilm膜夹营养液法对叶蝉成虫唾液进行收集,经超滤浓缩和电泳分离后,使用膜辅助样品制备技术法(filter-aided sample preparation, FASP)酶解,借助液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)检测蛋白,利用Mascot 2.2软件比对UniProt的细菌蛋白数据库进行查库分析从而鉴定唾液中的细菌蛋白。【结果】共鉴定到27个目49种细菌的142种蛋白。以变形菌门(Proteobacteria)细菌蛋白为主,共107个蛋白,其中又以α-变形菌纲(α-Proteobacteria)和γ-变形菌纲(γ-Proteobacteria)细菌蛋白占比最多。其次为厚壁菌门(Firmicutes)细菌蛋白,共28个蛋白,分别属于杆菌纲(Bacilli)和梭菌纲(Clostrida),这些蛋白参与氨基酸、维生素和能量代谢等。【结论】鉴定的细菌蛋白可能是叶蝉生活史的重要参与者。本研究为进一步研究共生菌、茶小绿叶蝉和茶树之间的关系提供基础信息。

摘要: 【目的】卵黄原蛋白受体(vitellogenin receptor,VgR)属于低密度脂蛋白受体,通过介导内吞作用为发育中的卵母细胞摄取卵黄原蛋白,为胚胎发育提供营养物质,在昆虫生殖过程中发挥关键作用。为研究黑尾叶蝉Nephotettix cincticeps VgR(NcVgR)基因的生理功能及其在生殖中的作用,本研究克隆并解析了NcVgR基因的序列,并对其时空表达进行了研究。【方法】根据黑尾叶蝉转录组数据信息,利用RT-PCR克隆了NcVgR基因,并进行了生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR研究了不同发育时期、成虫不同组织NcVgR的表达水平。【结果】NcVgR c DNA序列全长6 676 bp,开放阅读框长度5 568 bp,编码1 855个氨基酸,预测编码蛋白的分子量为206 k D,N端前17个氨基酸为信号肽。序列分析显示,NcVgR具有低密度脂蛋白家族的5个经典保守域,即:配体结合域(ligand-binding domain,LBD)、表皮生长因子前体同源域(EGF-precursor homology domain,EGFP)、O-糖链结构域(O-linked sugar domain,OLSD)、跨膜域(transmembrane domain,TMD)和胞质尾域(cytoplasmic domain)。系统发育分析表明,NcVgR与褐飞虱N.lugens VgR亲缘关系最近。实时荧光定量PCR结果显示,NcVgR转录起始时间为5龄若虫,羽化后转录水平逐渐上升,至羽化后8 d达到峰值,随后下降。有意思的是,随着黑尾叶蝉产卵,NcVgR转录水平再次上升,至羽化后16 d达到最高水平。组织定位结果显示,NcVgR在黑尾叶蝉雌成虫卵巢中特异性高表达,而在雌成虫脂肪体和肠道中微量表达,在雌成虫脑及雄成虫中均未检测到表达。【结论】NcVgR在黑尾叶蝉雌成虫卵巢中特异性表达,并且不同发育时期具有不同的表达量,这为研究黑尾叶蝉的生殖调控机理提供了分子信息。

摘要: 【目的】为开发假眼小绿叶蝉Empoasca vitis分子标记,采用高通量测序技术对假眼小绿叶蝉DNA进行了测序与分析。【方法】本研究基于Illumina Hi Seq测序技术,构建了PE文库(400bp),对获得的测序数据利用生物信息学分析手段完成全基因组扫描,并进一步使用MISA分析鉴定基因组序列中出现的微卫星序列(SSR)。针对微卫星序列共设计10对引物,并使用3步法进行引物多态性筛选。【结果】共计检测Scaffold数量为183 194条,其中包含SSR的Scaffold共计1 545条,共计筛选出1 569个SSR位点。在假眼小绿叶蝉的微卫星中,共包括87种重复基元类型,二核苷酸与三核苷酸重复序列为主要重复类型,分别占SSRs总数的70.26%和27.84%;二核苷酸重复基元CA/TG和三核苷酸重复基元AAT/ATT是优势重复基元,分别占SSRs总数的33.96%和5.86%。在设计的10对引物中,5对具有多态性,在8个假眼小绿叶蝉个体中共发现16个等位基因。【结论】结果说明假眼小绿叶蝉SSR位点在多态性方面具有极大的可开发性,具有多态性的SSR位点可对假眼小绿叶蝉种群间的分化,种群间的扩散机理和途径及影响因素等问题提供分子视角。

摘要: 【目的】目前发现,北京枣园中的凹缘菱纹叶蝉Hishimonus sellatus(Uhler)和片突菱纹叶蝉Hishimonus lamellatus Cai混同发生。已知凹缘菱纹叶蝉可以传播枣疯病,而片突菱纹叶蝉是否携带枣疯病植原体尚待证明。正确鉴别区分枣园中菱纹叶蝉的种类并测定其体内感染枣疯病植原体情况有助于阐明田间枣疯病的流行规律,从而提出有效的预防枣疯病及其媒介昆虫措施显得十分重要。传统形态学鉴定两种菱纹叶蝉种类的方法局限于雄性成虫外生殖器,本研究目的在于建立一种快速的分子生物学方法,在区分枣园中两种枣菱纹叶蝉的同时,可检测虫体内的枣疯病植原体。【方法】以凹缘菱纹叶蝉和片突菱纹叶蝉的COI基因以及枣疯病植原体的16S r DNA为扩增目标,分别设计引物,建立一种包含3对引物的多重PCR体系。测试该多重PCR体系对叶蝉总DNA的灵敏度、准确性,以及当两种叶蝉DNA同时存在时的辨别能力和对枣疯病植原体16S r DNA的灵敏度。【结果】该多重PCR可以准确区分凹缘菱纹叶蝉和片突菱纹叶蝉,并对虫体内枣疯病植原体实现检测,其对昆虫总DNA的灵敏度达到0.012 ng,对枣疯病植原体16S r DNA模板的灵敏度达到900拷贝。【结论】该方法极大方便了对枣菱纹叶蝉的田间种群发生动态及虫体中枣疯病植原体感染的监测。