摘要: 【目的】丝氨酸蛋白酶(serine protease,SP)是一类以丝氨酸为活性中心的重要的蛋白水解酶。本研究旨在克隆获得沙葱萤叶甲Galeruca daurica丝氨酸蛋白酶基因,分析其对温度胁迫的响应,以期为进一步揭示沙葱萤叶甲耐温性的调控机制及其他生理功能奠定基础。【方法】根据沙葱萤叶甲2龄幼虫转录组数据,采用RACE技术克隆得到沙葱萤叶甲丝氨酸蛋白酶基因的cDNA全长序列,并进行生物信息学分析;应用qPCR技术检测其在不同温度(-10,-5,0,5,25和35℃)下处理1 h后及25℃下恢复30 min后在沙葱萤叶甲2龄幼虫中的表达量变化。【结果】自沙葱萤叶甲克隆获得一个丝氨酸蛋白酶基因,命名为GdSP(GenBank登录号:MG797556)。该基因全长1 110 bp,开放阅读框969 bp,编码322个氨基酸;蛋白预测分子量35.41 kD,等电点5.61;编码蛋白具有丝氨酸蛋白酶的典型特征,具有一个跨膜结构,无信号肽。同源序列比对和系统发育分析表明,GdSP与光肩星天牛Anoplophora glabripennis SP的同源性最高,氨基酸序列一致性为30.53%。qPCR测定结果表明,不同温度处理间2龄幼虫中GdSP表达量差异不显著,但对各高低温(-10℃除外)胁迫处理回温后GdSP表达量显著上升。【结论】快速冷驯化对沙葱萤叶甲丝氨酸蛋白酶基因表达无显著影响,而回温可诱导其上调表达。

摘要: 【目的】明确沙葱萤叶甲Galeruca daurica成虫在越夏不同阶段主要生理生化指标变化的特点,为进一步揭示其越夏的机理提供基础。【方法】分别采用蒽酮硫酸法和氯仿-甲醇法测定越夏不同阶段(越夏前、越夏期和越夏后)的沙葱萤叶甲成虫体内总糖、海藻糖、糖原、脂肪及水分含量;采用考马斯亮蓝G-250染色法测定总蛋白含量。【结果】总糖、水分和总蛋白含量在沙葱萤叶甲成虫越夏前(分别为26.81μg/mg,77.47%和63.17μg/mg)和越夏后(分别为26.4126.85μg/mg,75.29%76.65%和59.5364.93μg/mg)显著高于越夏期(分别为18.7721.14μg/mg,61.50%67.20%和39.8252.54μg/mg),而糖原含量变化趋势正好相反(越夏前:8.43μg/mg;越夏后:5.916.14μg/mg;越夏期:10.1811.58μg/mg),脂肪含量在越夏后(11.48%11.65%)显著低于越夏前(42.48%)和越夏期(36.05%64.79%);脂肪和总蛋白含量在越夏期间逐渐下降,而水分、总糖和糖原含量变化不明显;海藻糖含量在越夏不同阶段波动较大(2.6625.31μg/mg)。【结论】脂肪和糖原是沙葱萤叶甲成虫越夏的主要能源物质。

摘要: 【目的】沙葱萤叶甲Galeruca daurica是一种在内蒙古草原上爆发成灾的新害虫。昆虫的化学感受蛋白(CSPs)是一类水溶性小分子蛋白,其主要功能是识别和传导环境中的化学刺激至受体,参与众多昆虫行为。本研究旨在鉴定沙葱萤叶甲化学感受蛋白基因,并对其表达谱进行分析。【方法】通过筛选本实验室组装的沙葱萤叶甲转录组鉴定沙葱萤叶甲化学感受蛋白基因;采用实时荧光定量PCR方法分析其在沙葱萤叶甲不同发育阶段(卵、1-3龄幼虫、蛹和成虫)和成虫组织[触角、头(去触角)、胸、腹、足和翅]中的表达水平。【结果】鉴定出10个化学感受蛋白基因,将其命名为Gdau CSP1-10(Gen Bank登录号:KY885471-KY885480)。10条编码蛋白的氨基酸序列一致性范围为17.27%62.79%,彼此间分化程度较高。通过NCBI的Blast比对结果显示,Gdau CSPs与榆黄毛萤叶甲Pyrrhalta maculicollis的Pmac CSP氨基酸序列一致性最高,为90%。系统发育分析表明,4种Gdau CSPs首先与榆黄毛萤叶甲的Pmac CSPs聚为一支。实时荧光定量PCR结果显示,Gd CSPs在不同发育阶段中的表达量有显著差异,Gdau CSP4-5,Gdau CSP7-8和Gdau CSP10 5个Gd CSPs在成虫中的表达量显著高于其他发育阶段,而Gd CSP2在卵中的表达量显著高于其他发育阶段;Gd CSPs不仅表达于成虫触角中,在头(去触角)、胸、腹、足、翅等其他部位也有表达,且10个Gd CSPs在沙葱萤叶甲成虫各组织中有着不同的表达谱,其中Gdau CSP2,Gdau CSP4,Gdau CSP5,Gdau CSP8和Gdau CSP9 5个Gd CSPs在雌成虫触角中的表达量显著高于其他组织。【结论】结果提示化学感受蛋白在沙葱萤叶甲的生长发育和化学感受过程中可能起着不同的作用。本研究为进一步研究沙葱萤叶甲化学感受蛋白的生理功能及化学通讯的分子机理奠定了必要的基础。

摘要: [目的]探究以核桃扁叶甲Gastrolina depressa幼虫为食料的六斑异瓢虫Aiolocaria hexaspilota的生物学特性,为利用六斑异瓢虫控制核桃扁叶甲提供理论依据。[方法]在林间、室内条件下观察和记录六斑异瓢虫各虫态的生活史、形态特征、生活习性、发育历期和存活率,并测定六斑异瓢虫2,3和4龄幼虫及成虫对不同密度的核桃扁叶甲2龄幼虫的捕食能力;采用HollingⅡ模型拟合计算六斑异瓢虫对核桃扁叶甲2龄幼虫的捕食功能反应和寻找效应。[结果]六斑异瓢虫在山东省泰安市一年发生1代,以成虫越冬。4月下旬至5月中旬为产卵盛期,5月上旬至6月上旬为孵化盛期,5月下旬至6月下旬为化蛹盛期,6月上旬至7月中旬为羽化盛期。在(25±0.5)℃,相对湿度(RH) 80%±3%,光周期14L:10D的条件下,六斑异瓢虫的卵期、1龄幼虫期、2龄幼虫期、3龄幼虫期、4龄幼虫期和蛹期分别为(3.84±0.13),(2.24±0.25),(1.90±0.21),(2.85±0.46),(4.42±0.42),(5.68±0.30) d;存活率分别为93.18%,93.33%,96.43%,96.67%,94.00%和96.00%。平均单雌产卵量约800粒,产卵期为4060 d。六斑异瓢虫2,3和4龄幼虫及成虫对核桃扁叶甲2龄幼虫的捕食功能反应均符合HollingⅡ模型。六斑异瓢虫4龄幼虫对核桃扁叶甲2龄幼虫的日捕食能力(a'/T_h)最强,为78.67头;最大理论捕食量(1/T_h)最大,为53.76/d;处理单头猎物所需时间最短,为0.0186 d;六斑异瓢虫2龄幼虫对核桃扁叶甲2龄幼虫的日捕食能力(a'/T_h)最低,仅为31.20头。六斑异瓢虫对核桃扁叶甲2龄幼虫的捕食量与猎物密度呈正相关,而寻找效应与猎物密度呈负相关。模拟后的各方程经卡方检验,其理论值与观察值差异不显著。[结论]这些表明六斑异瓢虫对核桃扁叶甲幼虫具有较好的控制潜力。本研究可为今后更高效地利用六斑异瓢虫资源以及正确评价六斑异瓢虫对核桃扁叶甲幼虫的生物防治潜能提供理论依据。

摘要: 【目的】本研究旨在比较不同RNAi方法对沙葱萤叶甲Galeruca daurica幼虫热激蛋白基因(GdHsp60和GdHsp70)的沉默效率，以选择一种可高效降低靶基因表达水平的研究方法，明确这两个热激蛋白在沙葱萤叶甲幼虫抗寒性中的作用。【方法】分别通过饲喂法和显微注射法进行RNAi沉默沙葱萤叶甲1和2龄幼虫的GdHsp60和GdHsp70,采用qPCR检测GdHsp60和GdHsp70的沉默效率；通过显微注射法分别对GdHsp60和GdHsp70进行RNAi后24 h,用热电偶法测定沙葱萤叶甲2龄幼虫过冷却点和结冰点，生物测定沙葱萤叶甲2龄幼虫暴露于不同低温条件下(-6-14℃) 2 h的半致死温度(Ltemp_(50))以及在-5℃低温条件下处理不同时间后的半致死时间(Ltime_(50))。【结果】用饲喂法和显微注射法进行RNAi均可以降低GdHsp60和GdHsp70的表达水平，但显微注射法的沉默效率更高。与对照组(显微注射dsGFP)相比，沙葱萤叶甲2龄幼虫分别显微注射dsGdHsp60和dsGdHsp70 24 h后，GdHsp60和GdHsp70的表达水平均降至最低，分别降低了84.15%和92.38%。在沙葱萤叶甲2龄幼虫中，显微注射dsGdHsp60 24 h后其过冷却点、结冰点、Ltemp_(50)及Ltime_(50)值分别为-10.56±0.42℃,-7.66±0.56℃,-8.33℃和49.25 h,显微注射dsGdHsp70 24 h后其过冷却点、结冰点、Ltemp_(50)及Ltime_(50)值分别为-9.08±0.23℃,-6.09±0.28℃,-8.20℃和52.21 h,而对照组的分别为-14.71±0.11℃,-13.94±0.09℃,-10.63℃和87.13 h。与对照组(显微注射dsGFP)相比，在沙葱萤叶甲2龄幼虫分别显微注射dsGdHsp60和dsGdHsp70 24 h后过冷却点、结冰点和Ltemp_(50)显著上升，而Ltime_(50)值显著缩短。【结论】显微注射法可作为沙葱萤叶甲Hsp相关基因RNAi的主要干扰方法；沉默GdHsp60和GdHsp70基因均会显著降低了沙葱萤叶甲幼虫的抗寒能力。