摘要: 本研究旨在建立双峰驼胎儿耳缘组织成纤维细胞系。采集双峰驼胎儿耳缘组织,用植块培养法和消化分离法对其进行原代培养,差速消化和差速贴壁法进行继代培养和细胞纯化,并对培养细胞的形态、细胞活力、生长动力学、免疫组织化学、核型、绿色荧光蛋白基因质粒(GFP)转染表达以及微生物污染等生物学特性进行了分析。结果表明,原代和传代细胞形态正常,群体倍增时间(PDT)为47.2h,细胞生长较快;不同代数的染色体众数为2n=74;免疫组织化学鉴定波形蛋白抗体呈阳性,角蛋白抗体呈阴性;外源质粒能在该细胞内整合和正确表达;微生物污染检测呈阴性。因此该研究已成功建立了双峰驼胎儿耳缘组织成纤维细胞系,在细胞水平上保存了双峰驼这一国家重要种质资源,为基因组文库和体细胞克隆等研究提供了理想的生物材料。

摘要: 双峰驼IgG亚型包含IgG1、IgG2和IgG3,其中IgG2和IgG3为重链抗体,在结构上与IgG1存在显著差异。为获取双峰驼血清中的IgG1、IgG2和IgG3,并分析其抗原特异性和抗体特异性,本文交替使用Protein A和Protein G亲和层析柱,对其分离纯化,并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行鉴定;之后分别制备兔抗双峰驼IgG1、IgG2和IgG3的多克隆抗体,通过ELISA对制备的多克隆抗体的效价进行测定;最后应用Western blot评估这3个亚型多克隆抗体的特异性,进而对双峰驼血清中IgG1、IgG2和IgG3的抗原特异性进行分析。结果表明,应用Protein A和Protein G亲和层析柱成功分离纯化出双峰驼血清中的IgG1、IgG2和IgG3;并制备兔抗双峰驼IgG1、IgG2和IgG3的多克隆抗体效价均在1∶10 000以上,且所获得的多克隆抗体分别与IgG1、IgG2和IgG3之间均存在交叉反应,但兔抗双峰驼IgG1多克隆抗体较其它两个亚型多克隆抗体特异性低。结果证明,双峰驼IgG1、IgG2和IgG3均具有良好的免疫原性,三者结构虽存在显著差异,但其抗原特性类似。

摘要: 为探索细胞外基质相关蛋白在隐睾双峰驼的分布情况及其组织化学特征,应用电镜技术和多种组织化学方法比较了隐睾和正常睾丸的超微结构,组织化学特点及层粘连蛋白(LN)、Ⅳ型胶原(ColⅣ)和硫酸乙酰肝素糖蛋白(HSPG)的分布特征。结果显示:(1)与正常睾丸间质结构相比,光镜下隐睾生精小管发育不全,间质内胶原纤维稀疏,网状纤维分布明显,间质血管及生精小管固有膜PAS及AB阳性反应较弱。电镜下,隐睾生精上皮基膜明显增生,外围I型胶原纤维较少,管周肌样细胞不典型;间质毛细血管及Leydig细胞周围纤维细胞多见,而正常睾丸在间质毛细血管及Leydig细胞周围多分布有成纤维细胞。(2)免疫组织化学染色显示,正常睾丸组织的ColⅣ、LN及HSPG在Leydig细胞内均为强阳性表达,ColⅣ和LN在毛细血管内皮细胞强阳性表达,后者在Sertoli细胞的表达尤为明显,HSPG在精原细胞无表达;隐睾时ColⅣ、LN及HSPG在Leydig细胞内阳性表达均明显减弱,ColⅣ、LN在管周肌样细胞及毛细血管内皮细胞阳性表达也减弱明显,HSPG在精原细胞较强阳性表达,且在精子细胞呈强阳性表达。免疫组织化学图像分析结果显示,双峰驼正常睾丸组织中ColⅣ和LN的分布显著高于隐睾组织(P<0.05),HSPG检测结果在正常睾丸与隐睾之间无统计学差异(P>0.01)。该研究表明,双峰驼隐睾生精小管发育异常,间质组织中合成胶原纤维的能力下降,睾丸细胞外基质的重要成分ColⅣ、LN与正常组差异显著,其与生精小管及Leydig细胞异常发育有关,而HSPG在隐睾生精上皮的强阳性表达与精原细胞发育不成熟密切相关。

摘要: 为了比较双峰驼卵泡发育过程中卵泡液中差异表达的蛋白质,将卵泡按照直径分为6类,运用双向电泳技术构建双峰驼卵泡液蛋白质二维凝胶电泳图谱,凝胶经考马斯亮蓝染色后用PDQuest 8.0检测差异蛋白,结果表明在6类大小不同的卵泡中共检测到13个差异蛋白点,这些蛋白点经LC-MS/MS鉴定出7种不同的蛋白质,它们分别是:血红蛋白、toll-like受体9、抗凝血酶、聚泛素、γ纤维蛋白原、重组活化蛋白1和跨膜与卷曲螺旋域3。基于这些蛋白的功能和表达模式,结合实验结果讨论了这些蛋白质在生殖中的功能,发现toll-like受体9、聚泛素、γ纤维蛋白原和重组活化蛋白1可能与卵泡发育或卵母细胞的成熟有关。这些蛋白质的发现为了解双峰驼卵泡发育和卵母细胞成熟的生理机制奠定基础。

摘要: 本研究运用生物信息学软件分析并通过原核表达系统诱导双峰驼TLR1 (Toll-like receptors 1, TLR1)蛋白表达，制备兔抗双峰驼TLR1多克隆抗体，通过HE染色法和SABC免疫组织化学法检测其在双峰驼心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏中的表达。结果表明，得到的目的蛋白大小为62 kDa，与预测结果相符。重组蛋白主要以包涵体的形式表达。通过间接ELISA检测抗体效价为1∶64 000,Western blot检测原核表达的重组蛋白TLR1能与对应抗体特异性识别。HE和SABC免疫组化染色结果显示TLR1主要在双峰驼心脏的心肌细胞，肝脏的枯否细胞，脾脏的单核/巨噬细胞，肺脏的呼吸性细支气管上皮细胞、Ⅰ型肺泡细胞和Ⅱ型肺泡细胞，肾脏的远曲小管上皮细胞上呈阳性表达。综上表明，本研究成功制备的兔抗双峰驼TLR1多克隆抗体具有良好的特异反应性并能用于TLR1的免疫组化检测，且为进一步探究TLR1在双峰驼不同组织器官中所扮演的角色奠定了基础。