摘要: 为了探究半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)miR-200a和miR-200b在免疫应答中的作用,采用PCR方法克隆了半滑舌鳎miR-200家族的miR-200a和miR-200b的前体序列,长度分别为82和88 bp;用The mfold Web Server和Clustalx1.83软件对其前体序列进行了二级结构和同源性分析,miR-200a和miR-200b都具有典型的颈环结构,与其他物种具有较高的同源性。qRT-PCR分析结果显示,miR-200a和miR-200b在健康半滑舌鳎13种组织(肝脏、肠、脾脏、头肾、后肾、鳃、血液、脑、皮肤、肌肉、胃、心脏和卵巢)中均有表达,miR-200a在头肾中表达量最高,在血液中表达量最低,miR-200b在肝脏中表达量最高,在肌肉中表达量最低;miR-200a和miR-200b在鳗弧菌(Vibrio anguillarum)感染半滑舌鳎后不同时间点的4种免疫相关组织(肝脏、肠、脾脏和头肾)中的表达呈现出先上调后下降的规律,但表达达到峰值的时间点有所不同。miR-200a在肝脏和脾中的表达峰值出现在鳗弧菌感染后6h,在肠和头肾中则是鳗弧菌感染后12h,miR-200b在肠、脾和头肾中均在鳗弧菌感染后12h达到表达高峰;miR-200a和miR-200b在脂多糖(LPS)、肽聚糖(PGN)、葡聚糖(WGP)、聚肌胞苷酸(poly I:C)4种病原模拟物刺激后的半滑舌鳎肝脏细胞系中呈现出上调表达趋势,其中Poly I:C刺激半滑舌鳎肝脏细胞系后miR-200a上调表达趋势明显,6h的表达量为0h的9倍,在WGP刺激半滑舌鳎肝脏细胞后miR-200b上调表达趋势明显,2h的表达量为0的9倍。研究结果为揭示miRNA在半滑舌鳎免疫应答中的作用提供了科学依据。

摘要: 为探讨饲料中谷氨酰胺对半滑舌鳎稚鱼非特异性免疫以及低氧应激后HIF-1α表达的影响,实验共设计了4种谷氨酰胺添加量分别为0、0.5%、1.0%和2.0%的等氮等脂微颗粒饲料(游离谷氨酰胺测定值分别为0.03%、0.46%、0.91%和1.73%),饲喂35日龄半滑舌鳎稚鱼[平均干重(10.64±0.86)mg]。每天饱食投喂5次,养殖周期30d,养殖结束后进行低氧应激实验。研究结果表明,谷氨酰胺添加量为0.5%时半滑舌鳎稚鱼鱼体溶菌酶(LZM)活力显著高于未添加组(P<0.05)。饲料中不同谷氨酰胺水平对鱼体总一氧化氮合酶(TNOS)活力和诱导型一氧化氮合酶(i NOS)活力没有显著影响(P>0.05)。实验克隆了半滑舌鳎低氧应激关键基因——缺氧诱导因子1α(HIF-1α),得到749 bp半滑舌鳎HIF-1α核心序列,系统进化树分析表明半滑舌鳎HIF-1α氨基酸序列与大部分鱼类具有较高同源性。定量PCR结果显示,饲料中谷氨酰胺水平对低氧应激后半滑舌鳎稚鱼内脏团HIF-1α表达量未产生显著影响(P>0.05)。综上所述,在饲料中添加谷氨酰胺能够显著增强半滑舌鳎稚鱼鱼体溶菌酶活力(P<0.05),提高非特异性免疫水平。

摘要: 研究克隆了半滑舌鳎Cynoglossus semilaevis膜蛋白AKT-interacting protein(AKTIP)基因,研究了其在健康组织中的表达模式、鳗弧菌(Vibrio anguillarum)感染后免疫组织和不同病原物刺激外周血淋巴细胞中的表达特征。通过常规克隆和RACE技术,获得的半滑舌鳎AKTIP基因全长c DNA序列为1224 bp,其中包括5′-UTR为116 bp,3′-UTR为117 bp和完整的ORF序列891 bp,编码296个氨基酸,预测蛋白质的等电点(PI)为9.12,分子量是33.74 k D;同源比对发现半滑舌鳎AKTIP的氨基酸序列在不同物种之间具有较高的保守性;荧光实时定量PCR(q RT-PCR)检测到半滑舌鳎各个组织中均有AKTIP基因的表达,在卵巢中表达量最高;鳗弧菌感染半滑舌鳎后,AKTIP基因在肝、鳃、血液、肠、头肾和脾中均上调表达;病原模拟物PGN、LPS、poly I:C和WGP刺激半滑舌鳎外周血淋巴细胞均诱导AKTIP基因下调表达。研究表明半滑舌鳎AKTIP基因参与了机体免疫反应,为给半滑舌鳎免疫防御技术的研究提供理论依据。

摘要: 为开展半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)免疫学研究提供细胞平台,利用密度梯度离心法分离半滑舌鳎外周血淋巴细胞,采用短期细胞培养法分离悬浮淋巴细胞,悬浮淋巴细胞在含有0.3μg/m L的PHA的DMEM完全培养基,于24℃条件下可连续培养3—4d左右,采用自制的尼龙毛柱可将悬浮淋巴细胞中的非黏附淋巴细胞和黏附淋巴细胞成功分离;利用流式细胞仪结合特异抗体检测对非黏附淋巴细胞和黏附淋巴细胞进行鉴定,结果表明,非黏附细胞与鼠抗人FTIC-CD3单克隆抗体特异结合,为T样淋巴细胞;黏附细胞和鼠抗人FTICCD19单抗特异结合,为B样淋巴细胞。T细胞表面抗原受体TCRβ基因可特异性的在非黏膜细胞中表达,而在黏附细胞中不表达,证明分离获得的非黏膜细胞为T淋巴细胞,采用q RT-PCR(Quantitative Real-Time PCR)方法检测TCRβ基因表达,结果表明,TCRβ基因在半滑舌鳎肝、脾、头肾、后肾、小肠、胃、血液、鳃、皮肤、肌肉、心脏、脑、卵巢组织中均有表达,其中在肠、胃、脾、头肾中表达量较高;鳗弧菌感染后TCRβ基因在肝、脾、鳃中呈现明显的上调表达,且表达峰值出现在感染后72—96h,表明TCRβ基因在获得性免疫应答中起重要作用。

摘要: 对半滑舌鳎Cynoglossus semilaevis胚胎发育进行了组织学观察,首次描述了半滑舌鳎胚胎发育过程中脊索、眼囊、中胚层、脊髓底板、神经管、肠、耳囊、脑、口咽膜和心管等组织结构。半滑舌鳎眼原基出现后,肌节在胚体后部开始分化。随后神经管前端不断膨大形成脑原基,脑形成之后在后脑的后面形成耳囊。胚体形成后,脊索位于脑的腹面,在胚胎发育过程中脊索细胞空泡化。肠位于脊索腹面。脊索背部有一排立方体细胞,为脊髓底板,脊髓底板位于神经管腹面并延伸到后脑前端。心脏是含有红血球的一个薄壁管,位于胚体头部腹面,且与中脑平行。