摘要: 弓形虫表面抗原1(Surface antigen 1, SAG1)是虫体入侵宿主细胞的重要蛋白,与弓形虫的毒力密切相关,属于弓形虫病诊断和疫苗研究的重要候选分子。本研究表达了弓形虫RH株重组SAG1(Recombinant SAG1, rSAG1)蛋白并免疫双峰驼,分离、提取外周血淋巴单核细胞总RNA,以巢式PCR扩增骆驼重链抗体可变区(VHH),并将其连接至pHEN4载体,构建了SAG1噬菌体纳米抗体库,库容量为3.24×10～9cfu/mL,克隆阳性率90%。二轮淘选后富集因子为3.75×10～3。随机挑选40个阳性克隆测序,VHH基因编码的氨基酸序列同源性比对分析发现8个phage-ELISA值比较高的阳性克隆聚为3类。亚克隆至pMECS原核表达载体体外表达、纯化后获得8个大小约17 kDa的Anti-SAG1-Nb。免疫印迹结果显示Anti-SAG1-Nb-5能够与弓形虫天然抗原反应并产生明显的特异性条带。生物膜干涉法进一步获得该纳米抗体与SAG1的亲和常数为1.66 nmol/L。本研究首次构建了弓形虫SAG1纳米抗体库,淘选、制备并鉴定了8个Anti-SAG1-Nb,为弓形虫感染的早期检测试剂研制奠定了基础。

摘要: 构建弓形虫致密颗粒蛋白14(GRA14)的真核表达质粒,研究其对小鼠的免疫保护力。扩增弓形虫RH强毒株gra14基因并构建p VAX1-gra14真核表达质粒,免疫BALB/c小鼠。60只小鼠随机分成4组,实验组小鼠肌肉注射100μg p VAX1-gra14质粒,对照组分别注射PBS(100μL/只)和p VAX1空质粒(100μg/只),空白对照不作处理。共免疫3次,每次间隔14 d。ELISA法检测免疫后Ig G、亚型抗体和细胞因子水平。攻击实验后比较小鼠生存率,分析p VAX1-gra14的免疫保护作用。结果显示成功扩增gra14基因并构建真核表达载体,Western blot结果显示目的基因成功表达并具有反应原性,p VAX1-gra14免疫后小鼠的Ig G抗体水平显著升高,IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10的表达量分别为652.47±14.55、455.53±7.88、228.13±14.51和252.13±14.20 pg/m L,同时免疫后实验组小鼠的生存时间相比对照组显著延长,平均生存时间为14.1±1.3 d。以上结果表明,p VAX1-gra14能够诱导特异细胞免疫和体液免疫反应,产生一定的免疫保护作用。

摘要: DNA疫苗是将编码抗原的基因插入载体质粒中构成重组体,直接接种机体,在接种部位摄取表达并达到抗感染目的的一种疫苗。p CMV-Taq2B载体具有人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus,CMV)高效启动子/增强子序列,可使目的基因在真核细胞中高水平稳定表达成为DNA疫苗载体。构建p CMV-Taq2BSurface antigen 2(表面膜抗原2)(p SAG2)、p CMV-Taq2B-Dense granule protein 2(致密颗粒蛋白2)(p GRA2)及p CMV-Taq2B-SAG2-GRA2(p SAG2-GRA2)DNA疫苗并研究其免疫保护效果。将p SAG2、p GRA2、p SAG2-GRA2 DNA疫苗(实验组)、磷酸盐缓冲液(Phosphate buffered saline,PBS)、p CMV-Taq2B空质粒(对照组)分别肌肉注射BALB/c小鼠,ELISA法检测血清Ig G抗体水平。末次免疫后第28 d,各组每只小鼠经腹腔注射弓形虫速殖子1 000个,观察小鼠的生存时间。结果显示单基因疫苗p SAG2、p GRA2和双基因疫苗p SAG2-GRA2免疫组均能诱导产生特异性Ig G抗体,且于末次免疫后第28 d达到最高值,此时单基因疫苗p GRA2(0.382±0.66)和双基因疫苗p SAG2-GRA2(0.548±0.137)免疫组吸光度值显著高于PBS(0.137±0.016)或p CMV-Taq2B(0.135±0.010)对照组吸光度值。免疫单基因疫苗p SAG2(14.3±1.8)、p GRA2组(13.5±2.1)小鼠存活时间(d)明显长于PBS(4.3±1.6)及p CMV-Taq2B组(4.1±1.3),且双基因疫苗p SAG2-GRA2组(19.6±2.4)小鼠存活时间明显长于单基因疫苗p SAG2组及p GRA2组。弓形虫双基因疫苗p SAG2-GRA2能够诱导小鼠产生抗弓形虫感染保护性免疫,其免疫保护性优于p SAG2、p GRA2单基因疫苗。

摘要: 本研究在大肠杆菌工程菌中重组表达弓形虫棒状体蛋白2(ROP2),并初步评价其免疫反应性。主要步骤为体外细胞培养速殖子,提取总RNA,反转录获得cDNA,PCR扩增ROP2基因全长,与pET-41 Ek/LIC载体通过基因重组直接连接,在大肠杆菌RosettaTM(DE3)pLysS工程菌中诱导表达重组融合蛋白GST-6×His-ROP2,最后以重组蛋白与人源弓形虫抗血清的Western blotting反应评价rROP2免疫反应性。本研究获得了ROP2全长重组蛋白,初步证明其良好的免疫反应性,为进一步改进弓形虫免疫学诊断方法,研究分泌蛋白与宿主细胞的相互作用奠定了基础。

摘要: 为确定引起广东环尾狐猴(Lemur catta)疑似弓形虫病的病原,从2只死亡的环尾狐猴体内无菌采集肺脏、肝脏、心、肾和脑等组织制作常规石蜡切片,HE染色。通过病理组织学观察,鉴定为弓形虫(Toxoplasma sp.)后,采用PCR-DNA测序分析方法对环尾狐猴源分离虫株(TgRTL1)的SAG1、SAG2、SAG3、BTUB、GRA6、L358、PK1、c22-8、c29-2和Apico基因位点进行PCR扩增、克隆和测序,采用DNAStar和MEGA5.05软件,将所获序列与网上下载的弓形虫RH株、ME49株和VEG株相应序列进行比对和同源性分析,并构建系统发育树。结果显示,从广东分离的环尾狐猴源弓形虫株,在10个遗传位点经PCR-DNA测序分析,确定该虫株的基因型为Toxo DB#3。本研究是对中国环尾狐猴源弓形虫采用多位点DNA序列分析进行基因型鉴定的首次报道,为进一步研究我国弓形虫流行病学、生物学特性以及弓形虫病的诊断提供了科学理论依据。