摘要: 为研究克氏原螯虾(Procambarus clarkii)Rab5(PcRab5)和Rab6(PcRab6)的生物学功能,利用同源重组技术构建了克氏原螯虾pET-B2m-PcRab5和pET-B2m-PcRab6原核表达载体,并进行了诱导表达和多克隆抗体的制备,采用ELISA和Western Blot技术检测了抗体效价和特异性。将PcRab5和PcRab6的原核表达蛋白和多克隆抗体注射到健康克氏原螯虾体内,研究了其对血淋巴细胞吞噬活性的影响。实验结果表明构建的pETB2m-PcRab5和pET-B2m-PcRab6原核表达载体经诱导后可表达目的蛋白,分子量均为67 kD,纯化后蛋白条带单一,纯度较高。重组表达纯化后的Pc Rab5和Pc Rab6蛋白免疫日本大耳兔分别获得效价为1:2048 K和1:512 K的兔抗血清,制备的抗体可分别特异性识别PcRab5和PcRab6蛋白。将PcRab5和PcRab6蛋白注射健康克氏原螯虾后,其血淋巴细胞中可吞噬荧光微球的细胞比例分别显著上升至38%和30%(P<0.01)。而将纯化的PcRab5和PcRab6多克隆抗体分别注射至螯虾体内后,其血淋巴细胞的吞噬细胞比例均出现显著下降(P<0.05), PcRab5和PcRab6蛋白参与了血淋巴细胞吞噬功能。实验为进一步研究克氏原螯虾PcRab5和PcRab6分子功能奠定基础,也可为理解甲壳动物Rab5和Rab6在血淋巴细胞吞噬功能中的作用提供帮助。

摘要: 为探讨持续高温胁迫对克氏原螯虾(Procambarus clarkii)生长及健康的影响,分别在适宜温度(24℃,对照)和不同高温胁迫温度(29℃、32℃和35℃)条件下对该虾[体重(7.19±0.29) g]进行了为期30d的养殖试验。结果显示:(1)随着胁迫温度的升高克氏原螯虾的成活率(SR)显著下降(P<0.05);终末体重(FBW)、终末体长(FBL)、增重率(WGR)及特定生长率(SGR)等生长指标随着温度呈先升高后降低的趋势。在29℃时生长性能指标达到峰值并显著高于其他3个温度组(P<0.05);与24℃相比, 32℃的高温胁迫对该虾的生长性能未造成显著影响(P>0.05)而35℃的高温则使其生长性能显著下降(P<0.05);(2)胃蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性随着温度升高呈先升高后降低的趋势。在29℃时3种消化酶活性达到峰值并显著高于其他3个温度组(P<0.05),在32℃时淀粉酶和脂肪酶的活性显著高于对照组(P<0.05),在35℃时胃蛋白酶活性显著低于对照组(P<0.05);(3)在高温胁迫条件下,随着温度上升血淋巴中的酸性磷酸酶(ACP)和碱性磷酸酶(AKP)的活性显著降低,而谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)的活性逐步显著升高(P<0.05);肝胰腺的总抗氧化能力(T-AOC)和总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性在29℃时最低(P<0.05)且T-SOD活性显著低于其他温度组(P<0.05),而丙二醛(MDA)含量随温度上升而逐步显著升高(P<0.05);肝胰腺和鳃组织的热应激蛋白基因(HSP70)相对表达量在29℃时显著上升(P<0.05)且在35℃时最高(P<0.01)。结果表明, 29℃的持续高温虽可显著促进克氏原螯虾的生长与消化但对其免疫指标显著不利,而32℃及以上的持续高温胁迫则严重影响其存活与生长、消化、免疫及抗氧化功能。

摘要: 抗菌肽是无脊椎动物非特异性免疫系统中重要的免疫因子，抗菌肽具有良好且广谱的抗菌活性，并且不易产生耐药性，有望替代传统抗生素药物发挥功能。甲壳素(Crustin)是目前甲壳类动物中研究比较广泛的一类抗菌肽家族。研究鉴定了来自克氏原螯虾(Procambarus clarkii)中的一种新型Crustin基因，命名为PcCruL。通过Pc-CruL抵抗病原性细菌的免疫防御反应的初步探究，发现Pc-CruL对克氏原螯虾的天然免疫系统至关重要，为深入研究克氏原螯虾奠定了一定的基础，在克氏原螯虾的人工养殖过程中的疾病的预防和治疗中具有一定的指导意义且提供了一定的理论基础。Pc-CruL包含330 bp，编码109个氨基酸，与已知的克氏原螯虾甲壳素同源性较低，为Ⅰ型甲壳素蛋白家族新成员。Pc-CruL在健康的克氏原螯虾的血淋巴、鳃、肠道、胃、心和肝胰腺中均存在，在血淋巴中的含量最高，而在肝胰腺中含量最低。同时进行了体外抑菌实验，结果表明Pc-CruL重组蛋白显著地抑制了几种常见的病原性细菌的生长，具有良好的广谱抑菌活性。体内实验表明，对健康的克氏原螯虾注射Pc-CruL重组蛋白可以保护克氏原螯虾，在副溶血弧菌感染后，提高存活率。Pc-CruL是克氏原螯虾中关键的免疫因子，在克氏原螯虾抵抗外界病原菌入侵和感染过程中起着重要的作用。

摘要: 研究旨在探究饥饿胁迫对克氏原螯虾(Procambarus clarkii)血淋巴生理生化指标、肠道组织病理和肠道微生态的影响。对克氏原螯虾进行为期28d的饥饿胁迫,分别于饥饿0、7d、14d和28d采集血淋巴和肠道样品。血淋巴生化分析结果表明,谷丙转氨酶(ALT)没有发生显著变化,血糖(GLU)水平随着饥饿时间延长逐渐降低(P<0.05),尿素(UREA)、甘油三酯(TG)水平呈现先上升后下降趋势(P<0.05),而总蛋白(TP)和谷草转氨酶(AST)则出现先下降后上升的趋势(P<0.05)。采用HE染色和TUNEL检测技术对肠道组织切片观察发现,饥饿胁迫使得克氏原螯虾肠道形态发生显著改变,肠腔变宽,肠绒毛萎缩,肌肉层厚度变薄,组织细胞凋亡指数上升。对肠道微生物16S rRNA V3—V4区进行高通量测序, Alpha多样性分析表明饥饿第7天肠道微生物多样性高于第0、第14和第28天。在门水平上12个样品主要以变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门(Firmicutes)等厌氧微生物为主,但在饥饿胁迫的第7天,厌氧微生物(Bacteroidetes、Firmicutes和Proteobacteria)在门水平丰度显著减少;属水平上则主要以拟杆菌属(Bacteroides)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、链球菌属(Streptococcus)、奈瑟菌属(Neisseria)及嗜血杆菌属(Haemophilus)为主,其属水平丰富度随饥饿程度的加深出现动态变化,在第7天出现最小值。综合研究发现,克氏原螯虾在面临食物短缺问题时,可能会通过改变能量物质利用途径适应饥饿代谢过程,同时不同程度饥饿胁迫会产生强烈的肠道应激反应,其菌群组成结构在不同水平的物种丰度上均发生显著变化。长期饥饿会导致肠道绒毛萎缩,细胞凋亡指数增加,可能影响虾的健康。

摘要: 为研究性别和生长阶段对克氏原螯虾(Procambarus clarkii)肠道菌群的影响,实验对来自虾塘的雌雄成虾肠道样品及来自实验室养殖的幼虾和成虾的肠道样品进行了16S rRNA高通量测序分析。结果表明,不同性别间克氏原螯虾肠道菌群的多样性和功能均没有显著性差异(独立样本t检验:P>0.05),其优势菌群在门水平上均包括厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)等;属水平上包括拟杆菌属(Bacteroidia)、希瓦氏菌属(Shewanella)、梭菌属(Clostridium)和柠檬酸杆菌属(Citrobacter)等;但各优势菌群在个体间的丰度差异较大,且在成虾阶段趋于保守,属肠道常驻菌群。幼虾肠道菌群的Alpha多样性显著高于成虾(独立样本t检验:P<0.05)。在门水平上,优势菌群较为一致,包括变形菌门、拟杆菌门、厚壁菌门和放线菌门(Actinobacteria)。成虾厚壁菌门与拟杆菌门的比例高于幼虾,表明成虾分解食物和吸收营养的潜力更强。在属水平上,成虾和幼虾肠道中均存在大量的黄杆菌属(Flavobacterium)、拟杆菌属和氢噬胞菌属(Hydrogenophaga),这些菌属可以帮助机体进行多种营养代谢,成虾肠道中与碳水化合物代谢相关的菌群多于幼虾。PICRUSt功能预测显示,在克氏原螯虾肠道中,营养代谢功能相关的菌群相对丰度最高,而成虾肠道菌群代谢碳水化合物的功能显著高于幼虾。实验表明,在野外虾塘养殖下的克氏原螯虾的肠道菌群不论是在群落多样性、物种丰度还是菌群功能预测上,都未体现出性别间的差异,且肠道菌群的个体差异较大;但在不同生长阶段间,克氏原螯虾肠道微生物的群落多样性、丰度及功能都有显著差异,相比于幼虾,成虾肠道菌群多样性降低,多种代谢功能升高。