摘要: 【目的】研究中华按蚊Anopheles sinensis气味结合蛋白1(Asin OBP1)与避蚊胺(N,N-diethylm-toluamide,DEET)的结合特性,并与埃及伊蚊Aedes aegypti Aaeg OBP1、致倦库蚊Culex quinquefasciatus Cqui OBP1进行比较,分析与DEET互作的关键氨基酸残基。【方法】利用原核表达载体进行目的蛋白Asin OBP1的原核表达及纯化。以N-苯基-1-萘胺(N-phenyl-1-naphthylamine,1-NPN)作为荧光探针,通过荧光竞争结合实验对Asin OBP1与DEET的结合特性进行分析,并比较Asin OBP1,Aaeg OBP1和Cqui OBP1与DEET的结合能力,通过分子对接鉴定其与DEET互作的氨基酸残基。【结果】Asin OBP1能与DEET结合,解离常数为29.55μmol/L。在相同实验条件下,Cqui OBP1和Aaeg OBP1都能结合DEET,解离常数分别为17.15和12.81μmol/L。与Aaeg OBP1和Cqui OBP1相比,Asin OBP1结合DEET的能力最弱,Aaeg OBP1最强。分子对接显示,DEET分子结合在Asin OBP1二聚体靠近交界面的结合口袋边缘,结合口袋由α4,α5和α6上的氨基酸残基Leu-92,Leu-95,His-96,Leu-99,Ala-107,Met-108,Met-110,Gly-110,Cys-114,Leu-115,Trp-133,Met-108',Lys-112'和Leu-115'组成。比较分析发现3个蛋白中与DEET甲苯基团形成疏水性作用的氨基酸残基、与DEET羰基氧形成氢键的氨基酸残基是相同的,但与DEET二乙基侧链形成疏水性作用的氨基酸残基中,有一个位置存在差异,Aaeg OBP1是Leu,而Asin OBP1和Cqui OBP1是Met残基。Leu的疏水性强于Met,可能是Aaeg OBP1与DEET的结合能力较强的原因之一。【结论】Asin OBP1能够结合DEET,不同蚊虫气味结合蛋白1与DEET的亲和力存在差异,进一步探索这些差异形成的原因对于阐明气味结合蛋白与DEET互作的模式具有重要的参考价值。

摘要: 【目的】对中华按蚊Anopheles sinensis谷胱甘肽-S-转移酶E6(As GSTE6)进行初步晶体学研究,为深入研究其空间结构奠定基础。【方法】利用生物信息学软件,首先对中华按蚊As GSTE6进行生物信息学预测和分析;然后进行分子克隆,构建重组子p ET28a-As GSTe6;利用大肠杆菌Escherichia coli原核表达系统进行诱导表达;采用Ni-NTA金属螯合层析和葡聚糖凝胶层析的方法对重组蛋白进行纯化;通过葡聚糖凝胶层析和化学交联的结果分析蛋白的聚合状态;运用坐滴蒸气扩散法对重组蛋白进行结晶筛选。【结果】生物信息学分析结果表明,As GSTE6分子量为25.28 k D,无信号肽和跨膜区,是亲水性蛋白;三级结构预测结果显示,As GSTE6主要由一个小的βαβαββα折叠模式的N端结构域和一个大的全螺旋的C端结构域组成。多重序列比对结果表明,在不同昆虫中GSTE6具有高度保守性。分子克隆得到中华按蚊As GSTE6的编码基因As GSTe6序列,大小为672 bp。在大肠杆菌中As GSTE6主要在上清中有大量表达,为可溶性表达;通过镍柱亲和层析和凝胶过滤层析纯化出了高纯度且稳定的As GSTE6重组蛋白;凝胶过滤层析结合化学交联的结果证实体外纯化的融合蛋白As GSTE6主要呈二聚体状态;通过晶体筛选获得了As GSTE6的晶体。【结论】运用结晶学的方法获得了As GSTE6的晶体,这为后续解析As GSTE6的三维结构奠定了基础。

摘要: 【目的】本研究旨在鉴定中华按蚊Anopheles sinensis 8个消化型羧肽酶基因,并分析这些羧肽酶基因在血餐前后的表达模式。【方法】通过生物信息学方法分析中华按蚊8个羧肽酶基因的特征,采用半定量PCR或定量PCR(qRT-PCR)方法分别分析这些基因在中华按蚊不同发育时期不同组织和在取食血液前后中华按蚊雌成虫中肠中的表达情况。【结果】通过生物信息学分析发现,8个羧肽酶基因中,6个编码羧肽酶A(AsCPA-IAsCPA-VI),2个编码羧肽酶B(AsCPB-I和AsCPB-II)。表达分析发现,只有AsCPA-V在中华按蚊4龄幼虫中肠和中肠外组织(仅去掉中肠的虫体)中表达,可能为幼虫特异性表达的基因,其余7个羧肽酶基因既在幼虫期表达又在成虫期表达。取食血液后,AsCPA-I,AsCPA-II,AsCPA-III,AsCPA-IV,AsCPA-VI,AsCPB-I和AsCPB-II在中华按蚊雌成虫中肠中的表达明显受到血液的影响,但表达模式不一样,说明血液蛋白的消化是由多个基因协同作用的复杂生理过程。其中,AsCPA-I,AsCPA-III,AsCPA-IV,AsCPA-VI和AsCPB-II在取食血液后表达上调,且都在吸血后的24 h达到表达高峰。尤其是AsCPA-VI在吸血后24 h表达上调了约418倍,AsCPB-II上调了40倍,可能与血液蛋白的消化有关。而AsCPA-II和AsCPB-I基因的表达水平在中华按蚊取食血液后显著下调。【结论】本研究对中华按蚊8个消化型羧肽酶基因进行了鉴定和表达分析。AsCPA-I,AsCPA-III,AsCPA-IV,AsCPA-VI和AsCPB-II可能参与血液蛋白的消化,尤其是AsCPA-VI和AsCPB-II可能起着更为重要的作用。研究结果为深入剖析中华按蚊血液蛋白消化的分子机理奠定了基础。

摘要: 【目的】在全基因组水平鉴定中华按蚊Anopheles sinensis化学感受蛋白(chemosensory protein,CSP)家族基因,预测该家族基因的特征,研究代表性双翅目昆虫CSP基因的系统发育和进化。【方法】在NCBI数据库中下载CSP氨基酸序列作为询问序列,通过Blast和HMM方法在全基因组水平搜索和鉴定中华按蚊、冈比亚按蚊An.gambiae、埃及伊蚊Aedes aegypti和致倦库蚊Culex quinquefasciatus的CSP家族基因并命名;通过生物信息学方法预测中华按蚊CSP家族基因的特性(基因结构、基因组定位、剪切模式、Ka/Ks比值)、保守结构域和蛋白质结构等;通过MEGA软件用最大似然法(maximum likelihood,ML)推断该家族基因的系统发育。【结果】中华按蚊、冈比亚按蚊、埃及伊蚊和致倦库蚊基因组分别有8,8,43和27个CSP家族基因。中华按蚊CSP家族基因(AsCSPs)都有全长的转录组序列,编码116(AsCSP7)335(AsCSP5)个氨基酸;7个AsCSPs分布于Scaffold51上,AsCSP8分布于Scaffold116;AsCSP1AsCSP8分别有3,2,1,1,1,2,1和2个选择性剪切模式;AsCSP3的表达量最高,其FPKM值达到385.46。AsCSPs的N端信号肽由1737个氨基酸组成,均含有4个保守的半胱氨酸位点(CYS68,CYS75,CYS94和CYS97),这些位点界定了两个二硫键(CYS68-CYS75和CYS94-CYS97)。系统发育分析结果显示,4种蚊虫的8个CSP基因各自形成明显的支系,被命名为组CSP1CSP8(CSP1-CSP8 group)。埃及伊蚊和致倦库蚊分别有35和18个CSP基因形成了一个不为按蚊所共有的特殊支系,被命名为Culicinae-specific组。替换率结果显示,中华按蚊与冈比亚按蚊同源基因对的Ka/Ks值都小于1,说明CSP家族基因在进化过程中主要是受到纯化选择作用。【结论】本研究为蚊虫,特别是中华按蚊基因组CSP家族基因提供了信息框架,为进一步开展该家族基因的功能研究奠定了基础。

摘要: 【目的】中华按蚊Anopheles sinensis是我国及东南亚重要的传疟媒介。本研究在全基因组上鉴定和分析中华按蚊微卫星并注释微卫星相关基因的功能,为遗传分子标记的筛选提供依据,也为昆虫微卫星比较基因组学进一步研究提供基础。【方法】用MISA程序鉴定中华按蚊基因组微卫星;用Excel 2010统计微卫星长度,结合微卫星序列信息编写Perl脚本计算微卫星碱基含量;结合微卫星位置信息编写Perl脚本定位微卫星出现的基因区域,并对基因区的微卫星进行GO功能注释;运用WEGO比较中华按蚊和冈比亚按蚊An.gambiae含微卫星相关基因功能注释。【结果】共鉴定出105 981个微卫星,出现的密度是365.5个/Mb。其中100 391个(94.7%)微卫星是完整型微卫星,其余5 590个(5.3%)是复合型微卫星。单碱基微卫星最为丰富,共58 837个,占总微卫星数量的55.5%,其余依次是二碱基(30 345个,占28.6%)、三碱基(15 104个,占14.3%)、四碱基(1 530个,占1.4%)、五碱基(121个,占0.1%)和六碱基(44个,少于0.1%)微卫星。(A)n为最主要的微卫星,其次是(AC)n,(AG)n,(C)n,(AGC)n,(ATC)n,(ACG)n和(ACC)n,数量都在2 000个以上。中华按蚊基因组微卫星长度以1020 bp为主(87.1%)。这些微卫星的AT含量(63%)明显高于GC含量(37%),仅三碱基微卫星的GC含量(53%)略高于AT含量(47%)。90 632个微卫星(85%)分布在基因间区,15 349个(15%)微卫星分布在基因区。在基因区,2 782个(3%)微卫星分布在外显子区,12 567个(12%)分布在内含子区。GO注释比较中华按蚊和冈比亚按蚊含微卫星的基因,发现这两个物种各小类基因所占总基因数的百分比基本一致,但电子传递类(electron carrier)基因在中华按蚊所占百分比(0.9%)明显高于冈比亚按蚊(0.1%)。【结论】这是蚊虫中首个在全基因组上系统的微卫星研究工作,为进一步通过微卫星作为分子标记开展中华按蚊种群遗传学、遗传变异、功能基因的遗传定位和调控机制研究奠定了基础,也为昆虫微卫星的多样性和进化研究积累了科学素材。