摘要: 【目的】研究中华按蚊Anopheles sinensis细胞色素P450基因AsCYP9J5是否与溴氰菊酯抗性有关。【方法】PCR克隆中华按蚊AsCYP9J5的开放阅读框并进行生物信息学分析。采用RT-qPCR检测AsCYP9J5在中华按蚊溴氰菊酯敏感品系(WX-LS)和抗性品系(YN-LR和CQ-LR)雌蛹和雌成蚊以及WX-LS雌蛹头、胸、腹部前3节(腹部前端)、腹部剩余部分(腹部后端)和25 mg/mL溴氰菊酯诱导体外培养的雌蛹头中的表达量。基于上述AsCYP9J5表达量，于YN-LR和CQ-LR化蛹后20 h时雌蛹头部注射dsAsCYP9J5和dsEGFP进行RNAi,采用RT-qPCR检测成蚊中AsCYP9J5的表达量，统计溴氰菊酯处理后成蚊半数击倒时间(half knockdown time, KT_(50))、击倒率和死亡率。通过分子对接模拟预测AsCYP9J5与溴氰菊酯相互作用的氨基酸残基。【结果】克隆获得AsCYP9J5开放阅读框，全长1 626 bp,编码541个氨基酸，无信号肽和跨膜结构域。AsCYP9J5在YN-LR和CQ-LR不同发育阶段表达量不同，化蛹末期至羽化后9 h在YN-LR中的表达量显著高于在WX-LS中的，在化蛹后30 h至羽化后72 h期间CQ-LR中高表达，各发育阶段(化蛹后20 h除外) CQ-LR中的表达量均显著高于在WX-LS中的；AsCYP9J5在WX-LS雌蛹头部的表达量最高，其次是在胸部，而在腹部前端和腹部后端的表达量接近并最低。溴氰菊酯诱导12 h时WX-LS雌蛹头部AsCYP9J5的表达量比对照组上调了11倍，诱导24 h时AsCYP9J5的表达量略低于对照组。与注射dsEGFP的对照组相比，注射dsAsCYP9J5的YN-LR和CQ-LR处理组成蚊AsCYP9J5的表达量分别下调了约68%和38%,分别约提前10和20 min出现明显的击倒现象，击倒率明显升高，死亡率分别增加了28.6%和24.0%,表明沉默AsCYP9J5导致中华按蚊对溴氰菊酯的敏感度显著增加。分子对接模拟结果显示，溴氰菊酯可以进入AsCYP9J5的结合口袋，并且与Arg-488形成二元的Pi-阳离子相互作用，与AsCYP9J5的Phe-109发生稳定的T型Pi-Pi叠合，与Cys-348和Thr-344形成Pi-硫与Pi-孤对电子相互作用，侧链可以与AsCYP9J5的Gln-224形成稳定氢键相互作用，也可以与Ile-227,Leu-413和Lys-53形成稳定的疏水相互作用网络。【结论】本研究结果表明AsCYP9J5参与中华按蚊溴氰菊酯抗性表型的维持，这为进一步探究该基因编码的蛋白酶代谢溴氰菊酯的分子机理奠定了前期基础。

摘要: 【目的】利用P2C可以定向进入卵巢以及Gal4蛋白可与UAS序列稳定结合的特点，在中华按蚊Anopheles sinensis中建立高效的非胚胎期外源DNA投递技术系统。【方法】注射P2C-Gal4-DsRed重组蛋白至吸血后20 h时的中华按蚊雌成蚊腹部，通过冰冻切片荧光观察和Western blot检测分析重组蛋白P2C-Gal4-DsRed在卵巢中的投递效率；制备P2C-Gal4 DNA BINDING重组蛋白，构建包含12×UAS重复基序的转基因质粒和辅助质粒，通过电泳迁移实验分析重组蛋白P2C-Gal4 DNA BINDING和12×UAS重复基序间的体外结合；分别将体外孵育的P2C-Gal4 DNA BINDING+辅助质粒ITF36-12×UAS和P2C-Gal4 DNA BINDING+转基因质粒ITF2-12×UAS afm复合物注射入吸血后20 h时的中华按蚊雌成蚊腹部，于血餐后40 h时提取其卵巢组织DNA,并通过特异性引物PCR扩增和测序分析外源DNA在活体中的投递情况。【结果】100%注射P2C-Gal4-DsRed的中华按蚊雌成蚊卵巢在绿色滤光片下呈现明显的红色荧光，表明P2C-Gal4-DsRed重组蛋白能够被高效地导入雌成蚊卵巢中；P2C-Gal4 DNA BINDING重组蛋白能够与12×UAS重复基序以及含有该重复基序片段的质粒稳定结合；分别有91%和93%的注射了P2C-Gal4 DNA BINDING+ITF36-12×UAS和P2C-Gal4 DNA BINDING+ITF2-12×UAS afm的雌成蚊卵巢组织中能够检测到外源DNA片段。【结论】在中华按蚊中成功建立了基于P2C卵巢导向肽和Gal4-12×UAS重复基序结合特性的外源DNA投递技术体系；通过此技术平台能够便捷、快速和高效地实现质粒等DNA分子在中华按蚊卵巢中的投递，这为进一步简化转基因、过表达及基因敲入等遗传操作奠定了基础。

摘要: 【目的】在全基因组鉴定中华按蚊Anopheles sinensis含LY结构域的胰蛋白酶(LY-trypsin)基因,探究其分子特征、表达模式以及系统发育关系。【方法】以NCBI数据库中冈比亚按蚊An.gambiae、埃及伊蚊Aedes aegypti、黑腹果蝇Drosophila melanogaster和致倦库蚊Culex quinquefasciatus胰蛋白酶家族基因的氨基酸序列为询问序列,通过本地Blast搜索鉴定中华按蚊基因组中胰蛋白酶基因,将中华按蚊LY-trypsin基因依据其结构域特征及系统发生关系进行命名LY-trypsin。运用生物信息学方法预测中华按蚊LY-trypsin基因的结构、在scaffold的定位、结构域、系统发育关系,及其在中华按蚊不同发育时期、成蚊不同组织和吸血前后雌成蚊中的表达模式。【结果】在中华按蚊全基因组上共鉴定得到27个中华按蚊LY-trypsin基因;在黑腹果蝇、冈比亚按蚊、致倦库蚊和埃及伊蚊基因组中未鉴定到LY-trypsin基因。中华按蚊27个LY-trypsin基因分别编码3291 125个氨基酸,分子量在36.8125.5 kD之间,等电点在4.738.94间。其中,20个LY-trypsin具有信号肽,信号肽长度在1062个氨基酸之间。这27个中华按蚊LY-trypsin基因的外显子数为15个,内含子长6220 093 bp。这27个中华按蚊LY-trypsin基因被定位在11个scaffold上,其编码蛋白均有YWTD保守基序(LY基序);其中16个LY-trypsin基因所编码的氨基酸序列具有含丝氨酸、组氨酸和天冬氨酸催化三联体的活性位点。系统发育结果表明,27个中华按蚊LY-trypsin基因聚类为4个分支。在不同发育阶段,半数以上的中华按蚊LY-trypsin基因显示出相似的表达模式,在幼虫阶段均高水平表达;在中华按蚊不同成蚊组织中,LY-trypsin基因均有不同程度的表达;吸血前后雌蚊中仅有个别基因表达,并未发现表达特异性。【结论】本研究在中华按蚊基因组中首次鉴定出LY-trypsin基因,并揭示了这些LY-trypsin基因的分子特征和表达模式,为LY-trypsin基因的进一步研究提供了信息框架。

摘要: 【目的】在全基因组上鉴定中华按蚊Anopheles sinensis血红素过氧化物酶(heme peroxidase,HPX)家族基因,并预测其基本特征,探究双翅目中5种代表性昆虫HPX基因的系统发育关系和进化。【方法】以NCBI数据库中黑腹果蝇Drosophila melanogaster和家蚕Bombyx mori等昆虫HPX基因编码的氨基酸序列为询问序列,通过本地Blast搜索鉴定中华按蚊基因组上HPX家族基因,并鉴定了冈比亚按蚊Anopheles gambiae、致倦库蚊Aedes aegypti和埃及伊蚊Culex quinquefasciatus基因组上的HPX基因;基于冈比亚按蚊HPX基因的命名系统,对中华按蚊HPX基因进行命名;运用生物信息学方法预测了中华按蚊HPX基因的特征,包括基因的结构及在scaffold的定位,氨基酸的替换率和保守结构域,蛋白质3D结构等,通过与冈比亚按蚊共线性分析定位了中华按蚊HPX基因在染色体上的位置;基于HPX核苷酸序列,采用PAUP4.0和MEGA6.0软件利用最大相似法构建了5个双翅目代表性种HPX基因的系统发生树。【结果】中华按蚊基因组共有20个HPX基因,冈比亚按蚊、埃及伊蚊和致倦库蚊基因组分别有18,14和12个HPX基因。这4种蚊虫的HPX蛋白都被分类进入Peroxinectin,Peroxidasin,DBLPX和DUOX 4个亚家族,其氨基酸的分子量介于61.6186.6 k D之间(除As HPX8为29.6 k D)。中华按蚊20个HPX基因共具有98个外显子,75个内含子,其外显子与内含子分布模式在基因间差异较大。中华按蚊HPX基因被定位到10个scaffold上,对应到冈比亚按蚊的2R,3R,2L,3L和X染色体。这些中华按蚊HPX基因编码的氨基酸序列(除DUOX)都具有1个血红素结合位点和5个Ca(2+)结合位点,在N端和C端各具有2个半胍氨酸位点并界定了两个二硫键。中华按蚊与冈比亚按蚊同源基因对的ω值都小于1,说明HPX基因在进化过程中没有受到明显的环境选择压力。系统发育关系研究表明,5种双翅目昆虫的HPX基因可以分为16个组,其中11个组在进化上呈明显的单系,具有至少83%的bootstrap支持。【结论】本研究提供了中华按蚊的HPX基因的基础信息。不同蚊虫种具有相似分子量的HPX蛋白,这与HPX家族蛋白结构的高度保守性有关。蚊虫的DUOX随着主要功能位点的缺失逐渐失去其功能,这与其特殊环境适应相关。DBLPX亚家族的peroxidase结构域在HPX家族所有亚家族中是最保守的。

摘要: 【目的】羧酸酯酶(carboxylesterase,COE)是昆虫体内一类重要的解毒酶,与昆虫的抗药性相关。本研究旨在对中华按蚊Anopheles sinensis羧酸酯酶Ae7(Asae7)进行初步晶体学研究,为解析As Ae7的空间结构及探讨其分子功能奠定基础。【方法】首先对Asae7进行生物信息学分析,然后进行分子克隆,并利用原核表达系统在体外对Asae7进行重组表达;结合Ni-NTA金属螯合层析和葡聚糖凝胶层析方法纯化融合表达蛋白;通过葡聚糖凝胶层析和化学交联结果分析As Ae7的聚合状态;采用坐滴气相扩散法对As Ae7进行结晶筛选。【结果】生物信息学分析表明,As Ae7是亲水性蛋白,分子量为61.053 k D,无跨膜区和信号肽;3D结构预测结果分析显示,As Ae7采取的是α/β-水解酶超家族折叠模式。多序列比对结果表明,在不同昆虫中Ae7蛋白具有高度保守性。分子克隆得到中华按蚊As Ae7的编码基因Asae7序列,大小为1 626 bp。成功构建重组质粒p ET28aAsae7;在大肠杆菌Escherichia coli中表达的融合蛋白As Ae7主要分布在上清中。通过镍柱亲和层析和凝胶过滤层析纯化出了高纯度且稳定的目的蛋白;通过凝胶过滤层析和化学交联获得纯化的As Ae7主要呈单体状态;同时通过晶体筛选获得了As Ae7的晶体。【结论】运用结晶学的方法初步获得了As Ae7的晶体,为后续解析As Ae7的晶体结构以及在原子分辨率水平上直观阐释As Ae7参与代谢抗性的分子机制奠定了基础。