摘要: 【目的】建立中华按蚊Anopheles sinensis与雷氏按蚊Anopheles lesteri实时荧光定量PCR(qPCR)检测技术，为2种传疟按蚊的准确鉴定提供分子鉴定方法。【方法】建立2种按蚊的样本库，利用形态学方法和基因测序对蚊虫样本进行鉴定；合成并克隆阳性质粒质控品。从NCBI数据库上下载中华按蚊和雷氏按蚊的rDNA-ITS2序列，利用Prime3软件在线设计2种按蚊的引物和探针，并验证该PCR方法的最低检测限、敏感性、特异性和可重复性。【结果】收集并鉴定4种383头蚊虫，其中中华按蚊159头、雷氏按蚊104头、致倦库蚊Culex pipiens quinquefasciatus 60头和白纹伊蚊Aedes albopictus 60头。中华按蚊和雷氏按蚊的qPCR的最低检测限均为31.50拷贝/反应，标准曲线线性关系相关系数（R2）均为0.99。敏感性和特异性均为100%，重复性试验结果显示，中华按蚊和雷氏按蚊的组内和组间变异系数均小于2%。【结论】本方法所建立的TaqMan探针qPCR方法灵敏度高，特异性高，可用于中华按蚊和雷氏按蚊的分子鉴别。

摘要: 【目的】中华按蚊Anopheles sinensis Wiedemann是我国最主要的传疟媒介之一，本研究基于实验室饲养的中华按蚊，采用电镜扫描技术观察了中华按蚊不同发育阶段的形态学特征，对蚊虫的形态学、生长发育和基础生物学等的研究具有参考价值。【方法】配置1%锇酸、6%戊二醛等试剂，结合不同浓度的乙醇脱水和叔丁醇真空冷冻干燥技术制备了幼虫、蛹和成虫的电镜样品，使用日立SU3500扫描电子显微镜对其各个发育时期具有重要分类和鉴定意义的形态特征进行观察和描述。【结果】中华按蚊成蚊雌雄个体差异不大，喙与触须均接近等长。雄成蚊触角末端膨大弯曲，触须呈马尾状，梗节呈中间凹陷的圆饼状，腹部末端的尾器有一对钳状抱肢；雌成蚊喙细长，上颚和下颚均有锯齿，有利于刺破皮肤吸食血液，梗节饱满呈球状，腹部末端的尾器为一对向内弯曲的尾须，明显短于雄性的钳状抱肢。电镜下中华按蚊蛹整体呈蝌蚪状，呼吸管位于头部，开口呈锐角三角形，管缘部位有一圈较为平滑整齐的钝圆齿特征；尾鳍为两瓣，呈扇形，雄性蛹期的外生殖器明显较雌性长。4龄幼虫胸腹闭合连接，头部触角上有数量众多刺状感受器，腹部第8节末端背面有气门器。电镜下中华按蚊卵整体呈船形，船面较其它蚊种大，表面均匀分布有细粒状的小突起，大多数分布呈现六边形的花纹结构，精孔区位于卵背面两端，精孔扁平凹陷。【结论】中华按蚊各个发育时期电镜扫描的超微形态结构中，蛹的呼吸管和卵的外部形态特征均可以作为其重要的鉴别特征。该研究为中华按蚊的分类学以及蚊媒防控研究提供了更为详细和直观的形态特征鉴定依据。

摘要: 【目的】应用PCR技术检测甘肃地区中华按蚊Anopheles sinensis蚊胃血来源,研究其吸血习性。【方法】根据中华按蚊可能吸血对象(人、牛、猪、羊、鼠、鸡)的线粒体DNA细胞色素b序列的差异,设计种特异引物,建立聚合酶链反应(PCR)体系鉴定中华按蚊蚊胃血来源。同时,对人血、猪血、牛血、羊血、鼠血、鸡血及未吸血中华按蚊中提取的DNA进行检测,验证该方法的特异性;对吸饲人血后不同时间(6、12、24、36、48、60 h)的中华按蚊进行检测,测试该方法的敏感性。【结果】该方法可从已知动物血样和中华按蚊提取的DNA中分别扩增得到689 bp(人)、271 bp(牛)、453 bp(猪)、225 bp(羊)、485 bp(鼠)、266 bp(鸡)和468 bp(中华按蚊)大小的特异性条带;吸人血36 h内的中华按蚊均能扩增出特异性条带,在吸人血后48 h、60 h的中华按蚊中,均未扩出特异性条带。共检测10只现场中华按蚊,血源来自人、牛、猪分别为5只、2只、3只,其中1只蚊子兼吸人血和猪血。【结论】建立的PCR检测方法可鉴定中华按蚊蚊胃血来源,结果稳定可靠;甘肃地区中华按蚊不仅嗜吸人血,也可兼吸其他动物血。

摘要: 【目的】在全基因组水平鉴定、分类和命名中华按蚊Anopheles sinensis有机阳离子转运体(organic cation transporter, OCT)家族基因,为昆虫OCT基因提供信息框架。【方法】从NCBI, VectorBase和EMBL数据库下载冈比亚按蚊An.gambiae、黑腹果蝇Drosophila melanogaster和秀丽隐杆线虫Caenorhabditis elegans已知的OCT氨基酸序列作为询问序列,基于中华按蚊基因组与转录组测序数据,通过本地Blast搜索鉴定中华按蚊基因组上OCT基因;运用生物信息学方法预测中华按蚊OCT基因的基因结构、Scaffold定位和保守基序等特征,通过最大似然法构建中华按蚊OCT基因的系统发育树。【结果】中华按蚊共有54个OCT家族基因,分属于OCTA, OCTB和OCTC 3个亚家族,分别有33, 15和6个基因。除AsOCTA20和AsOCTB2外,其余OCT基因编码的氨基酸序列均具有MFS_1和Sugar_tr跨膜结构域(transmembrane domain, TMD),大多数OCT氨基酸序列有12个TMD。所有OCT氨基酸序列都有GRK-(PT)-VL, PES-(APVS)和EQFPT-(VI)-RN 3个保守基序,各亚家族还有各自的保守基序。4对基因(AsOCTB4a和AsOCTB4b,AsOCTA10a和AsOCTA10b,AsOCTA19a和AsOCTA19b,以及AsOCTA23a和AsOCTA23b)源自基因重复事件。AsOCTC基因较为原始,AsOCTB基因较为进化,都是明显的单系;AsOCTA基因介于两者之间,进化关系较为复杂。【结论】本研究丰富了中华按蚊基因组数据,为后续中华按蚊OCT基因功能特别是杀虫剂抗性机制方面的功能研究奠定了基础。

摘要: 【目的】克隆中华按蚊Anopheles sinensis气味结合蛋白2(odorant binding protein 2, OBP2)基因AsinOBP2,分析该基因的表达及其重组蛋白与人体气味物质的结合能力。【方法】采用RT-PCR和RACE技术克隆AsinOBP2的全长cDNA序列,通过qPCR分析AsinOBP2基因在中华按蚊不同发育时期(雌雄蛹及羽化后第0, 1, 2, 3, 6和9天的成虫)、3日龄成虫不同嗅觉组织(触角、喙和下颚须)和吸血前后3日龄雌成虫中的表达水平;通过原核表达和亲和层析,表达并纯化AsinOBP2重组蛋白,运用荧光竞争结合实验测定重组蛋白AsinOBP2与39种人体气味物质的结合能力。【结果】克隆并测序了AsinOBP2的全长cDNA序列(GenBank登录号:MT700441),其开放阅读框长492 bp,编码163个氨基酸,N末端30个氨基酸为信号肽序列,具有气味结合蛋白典型的6个保守半胱氨酸结合位点,属于Classic亚家族成员。qPCR结果显示,AsinOBP2在中华按蚊羽化后的表达水平逐渐增强,羽化后第6天表达水平最高,随后开始下降;AsinOBP2主要在雌成蚊触角中表达;吸食血液后3日龄雌成虫中AsinOBP2的表达水平显著下降。荧光竞争结合实验显示,在测定的39种人体气味物质中,重组蛋白AsinOBP2与12种化合物具有结合活性,其中与吲哚结合能力较强,解离常数Ki=27.15μmol/L,其次是与正丙胺、2-甲基丁醛和葵醛,解离常数Ki分别为42.49, 48.33和47.90μmol/L。【结论】根据AsinOBP2基因的表达特点及其重组蛋白与人体气味物质的结合能力,后者表明AsinOBP2对人体气味物质具有明显的选择结合特性,我们推断AsinOBP2在雌蚊追寻宿主的行为中起着重要的作用。