摘要: 为深入研究三疣梭子蟹Toll受体的功能,在前期工作的基础上构建了Pt Toll-1胞外结构域原核表达载体,并成功获得其重组蛋白。将获得的重组蛋白免疫小鼠获得抗此重组蛋白免疫抗血清用于后续研究。SDSPAGE结果表明,体外诱导表达重组蛋白r Pt Toll-1以包涵体的形式出现在大肠杆菌裂解液的沉淀中,分子量大小约为87.18 k D;Western-Blot分析表明,小鼠抗血清能与r Pt Toll-1特异性结合。利用免疫荧光及细胞免疫化学方法对三疣梭子蟹Pt Toll-1在消化道、肝胰腺、鳃、心脏和肌肉等组织及血淋巴细胞中的分布进行研究。此外成功构建Pt Toll-1完整蛋白的真核表达载体p EGFP-N2-Pt Toll-1,并转染HEK293T细胞研究其在哺乳动物细胞HEK293中的表达。组织免疫荧光结果显示,Pt Toll-1在三疣梭子蟹消化道、肝胰腺、鳃、心脏及肌肉等组织中均有分布,但在鳃及消化道的组织结构中表达较强;细胞免疫荧光及免疫化学结果均表明Pt Toll-1主要分布在血淋巴的细胞膜上;激光共聚焦显微技术观察发现,p EGFP-Pt Toll-1融合蛋白也主要在HEK-293T细胞膜上表达。研究结果将为三疣梭子蟹Toll受体蛋白的免疫学功能的研究奠定基础。

摘要: 为研究水通道蛋白AQP的生理功能,克隆了三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)水通道蛋白2基因(ptaqp2),该基因全长4126 bp,编码522个氨基酸,具有水通道蛋白基因家族的保守结构域及功能结构域;进化树聚类分析结果显示, ptaqp2基因属于水通道蛋白基因家族C-AQP类基因;组织表达结果显示, ptaqp2呈泛组织表达特征,在眼柄中的表达量最高,在肠和肌肉中也有较高表达,在血淋巴中的表达最低; ptaqp2基因在不同蜕皮时期呈显著差异表达(P<0.05),且在蜕皮前期表达量最高;在蜕皮激素(Molting Hormone简称MH)刺激下,该基因在肌肉、肠及胃中均呈不同程度的上调表达趋势;通过RNAi技术在蜕皮前期敲降ptaqp2的表达,发现能够显著推迟蜕皮过程。研究初步证明了ptaqp2基因在三疣梭子蟹蜕皮中发挥重要作用。

摘要: 为研究miR-139555及其潜在靶基因PtNBC(碳酸氢钠协同转运基因)在三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)适应盐度胁迫中的表达调控分析,利用RACE技术克隆了PtNBC基因,该基因全长5308 bp,开放阅读框(ORF)3570 bp,共编码1189个氨基酸。利用RT-PCR技术分析miR-139555和PtNBC基因在三疣梭子蟹不同组织及低盐胁迫(11)下的表达规律。组织表达分布结果显示, miR-139555和PtNBC基因均在三疣梭子蟹鳃组织中表达量最高,与其他组织相比,有显著差异(P<0.05)。体外双荧光素酶实验表明, miR-139555能够显著抑制PtNBC基因的表达(P<0.001)。低盐胁迫显著影响了miR-139555和PtNBC基因的表达,且两者间的表达趋势呈现明显的负相关。在低盐胁迫后, miR-139555整体呈现上调表达的趋势且在48h达到最大值,为对照组的4.9倍(P<0.05),而PtNBC基因呈现显著下调表达的趋势且各时间点表达量均低于对照组,在12h表达量最低,为对照组的0.06倍(P<0.05)。研究结果证明了PtNBC基因是miR-139555的靶基因, miR-139555可能通过调控鳃上皮细胞PtNBC基因的表达发挥重要的渗透压调节功能。

摘要: 为明确三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)DNA损伤诱导蛋白因子-4(DNA Damage Inducible Transcript like 4, DDIT4L)基因的结构和功能。利用RACE方法克隆获得三疣梭子蟹Pt-ditt4l基因全长。该基因序列全长2727 bp,其中ORF为507 bp,编码了一个168个氨基酸的蛋白,预测分子质量为19.14 kD,且在C端有一个高度保守的RTP801_C结构域。Blast相似性比对和系统进化树分析发现, Pt-ddit4l与凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)ddit4l基因的相似性最高为60%,且与凡纳滨对虾先聚为一支。梭子蟹不同发育阶段表达分析表明,Pt-ddit4l基因在发育早期发挥了一定的作用;组织表达分析显示, Pt-ddit4l基因在肝胰腺中的表达量最高,在血细胞中表达量最低。注射副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)后的感染实验表明,血细胞中Pt-ddit4l的表达量先上升后下降,在24h达到峰值,为对照组的8.85倍(P<0.05);而肝胰腺中则是整体呈下调的趋势,在72h时达到最低值,仅为对照组的1/40(P<0.05)。注射dsddit4l后该基因12—24h表达量显著下调,且注射dsddit4l后再进行弧菌感染的螃蟹的死亡率要显著远高于对照组。研究丰富了三疣梭子蟹DNA损伤诱导蛋白相关研究资料。

摘要: 实验研究了三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)卵巢发育过程中(Ⅰ—V期)组织色泽、类胡萝卜素组成与含量、抗氧化和非特异性免疫指标的变化规律,进一步探讨了肝胰腺中类胡萝卜素含量变化与抗氧化指标的关系。结果表明:(1)卵巢发育期间,卵巢指数(GSI)显著增加(P<0.05),肝胰腺指数(HSI)整体呈先升后降的趋势;卵巢的红度(a*)值和黄度(b*)值、肝胰腺的亮度(L*)值和b*值均呈显著上升趋势,但卵巢中L*值呈下降趋势。(2)在卵巢发育过程中,卵巢中的总类胡萝卜素、虾青素、叶黄素和β-胡萝卜素含量均为先升后降的趋势,虾青素含量在Ⅳ期最高;肝胰腺中的虾青素含量呈上升趋势,而β-胡萝卜素含量为显著下降趋势;内表皮中的总类胡萝卜素、虾青素、叶黄素、海胆烯酮和β-胡萝卜素含量均呈现下降趋势;就不同组织中类胡萝卜素含量而言,内表皮中虾青素含量最高。卵巢和肝胰腺的L*值与总类胡萝卜素含量呈显著负相关,卵巢的a*值和b*值均与总类胡萝卜素、虾青素、叶黄素、海胆烯酮和β-胡萝卜素含量呈显著正相关。肝胰腺的a*值与各类胡萝卜素含量无显著相关性, b*值仅与虾青素含量呈显著正相关。(3)肝胰腺中Ⅰ—V期T-AOC呈显著下降趋势(P<0.05),而SOD、CAT和GPX均为“先上升后下降”趋势;血淋巴中T-AOC呈现“高-低-高-低”的变化趋势,而SOD和GPX为“先上升后下降”趋势, CAT和MDA为“低-高-低-高”的变化趋势;卵巢发育过程中肝胰腺中ACP、ALP和NO整体呈下降趋势,而血淋巴中ACP、ALP和Hc在Ⅰ—Ⅳ期为上升趋势, V期略有下降。(4)相关性分析表明,肝胰腺中虾青素含量与T-AOC呈显著负相关,叶黄素含量与GPX呈显著正相关(P<0.01),其余类胡萝卜素含量与抗氧化指标均无显著相关性。综上,在三疣梭子蟹卵巢发育过程中,卵巢中总类胡萝卜素、虾青素和β-胡萝卜素的含量增加主要发生在Ⅱ—Ⅳ期,内表皮中大部分类胡萝卜素呈显著下降趋势,肝胰腺中仅虾青素呈上升趋势。